Endotoxines: de vergeten component van fijn stof

Sophie

Van Oevelen

Abbas

Alloul
Stijn

Wittouck

Endotoxines: de vergeten component van fijn stof
Abbas Alloul, Sophie Van Oevelen, Stijn Wittouck

Vandaag de dag worden we steeds meer geconfronteerd met luchtvervuiling. De socio-
economische gevolgen ervan zijn enorm: in een rapport gepubliceerd op 11 juli 2013 schatten
onderzoekers dat er jaarlijks 2,1 miljoen mensen sterven door het inademen van fijne
roetachtige deeltjes die men groepeert onder de naam “fijn stof ” [1]. Deze deeltjes ontstaan
vaak door toedoen van de mens; dieselmotoren, energiecentrales en verbranding van steenkool
zijn belangrijke bronnen. Op de roetachtige partikels die hierdoor gevormd worden, kun-
nen heel wat andere schadelijke stoffen zich hechten zoals microbiële endotoxines. Dit
zijn moleculen afkomstig van dode bacteriën. Ze vormen een van de vele componenten
van fijn stof en zouden mee verantwoordelijk zijn voor de nefaste gezondheidseffecten die
luchtvervuiling met zich meebrengt [2]. De rol van deze endotoxines is echter nog groten-
deels ongekend.
In de huidige literatuur is er veel te vinden over fijn stof en endotoxines, maar over de
interactie tussen deze twee stoffen is nog zeer weinig onderzoek gebeurd. Daarom werd er
in deze bachelorproef getracht om een beter beeld te krijgen van net die interactie.

1 Fijn stof schaadt je gezondheid
Fijn stof is opgebouwd uit verschillende fysische en chemische partikels. Componenten die bijna altijd
voorkomen, zijn koolwaterstoffen (zoals roetpartikels) waarop metalen, ionen en organische componenten
zoals endotoxines gebonden zijn. Wat belangrijk is om de gezondheidseffecten van fijn stof in te schatten
is niet zozeer de hoeveelheid deeltjes, maar wel de samenstelling en de grootte ervan. De gevaarlijkste fijn stof deeltjes zijn de “ultrafijne
partikels”. Dit zijn deeltjes met een diameter kleiner dan 0.1 µm. Door hun geringe grootte hebben ze
een extra grote impact op onze gezondheid, doordat ze dieper in onze longen kunnen doordringen. Er
bestaat een strenge wetgeving omtrent de PM waarden die niet overschreden mogen worden [3].
Een endotoxine is “een celcomponent van een micro-organisme dat onschadelijk is zolang de microbe
intact blijft; maar dat de verdedigingsmechanismen van de gastheer kan overstimuleren van zodra ze
wordt vrijgesteld door een gebarsten cel.” Endotoxines komen voor in de lucht als losse moleculen, maar hechten zich ook aan fijn stof deeltjes volgens een
nog onbekend mechanisme.
Lipopolysachariden (LPS) zijn het best gekende voorbeeld van endotoxines. Dit zijn componenten die
terug te vinden zijn in de celwand van zogenaamde gramnegatieve bacteriën, een grote groep bacteriën
met als typevoorbeeld de darmbacterie Escherichia coli. Een LPS molecule is opgebouwd uit drie basisdelen: een lipide-A gedeelte, een kerngedeelte
en een O-antigeen gedeelte, zoals te zien in figuur 1.
Het lipide-A gedeelte is opgebouwd uit vetzuren en is verantwoordelijk voor de immuunreactie van ons
lichaam.
Endotoxines worden dikwijls vergeten wanneer men de gezondheidseffecten van fijn stof onderzoekt. Een
review studie uit 2011 over de rol van endotoxines in de toxiciteit van fijn stof concludeert nochtans dat
veel ontstekingsveroorzakende effecten van fijn stof te wijten zijn aan endotoxines in dat fijn stof, en dan
vooral in PM10 [2]. Daarom is het van vitaal belang dat men bij het opmeten van luchtvervuiling niet
enkel kijkt hoeveel fijn stof er in de lucht hangt, maar ook naar de hoeveelheid endotoxines die de fijn
stof deeltjes bevatten.

2 Ons onderzoek: de afbraak van endotoxines
Een mogelijke oplossing om de schadelijke effecten van endotoxines te beperken is een manier vinden om
ze te neutraliseren. Fotokatalyse lijkt hiervoor een veelbelovende techniek.
In fotokatalyse wordt steeds gebruik gemaakt van een katalysator. Dat is een stof die deelneemt aan
de reactie maar er niet in verbruikt wordt. Om endotoxines af te breken kan men gebruik maken van
titaniumdioxide (TiO2 ) in de vorm van kleine korreltjes als katalysator. Onder invloed van bestra-
ling met UV-licht kunnen elektronen in het TiO2 geëexciteerd worden. Doordat de elektronen naar een
hoger energienieveau getild worden, ontstaan er “elektron-gaten” waarin elektronen kunnen springen van
stoffen uit de nabije omgeving, bijvoorbeeld water of zuurstof. Door elektronen af te staan worden deze
stoffen omgevormd tot zogenaamde radicalen: zeer agressieve stoffen die in het wilde weg reageren met
zowat alles wat ze tegenkomen. Deze radicalen zorgen dan voor de afbraak van organische componenten
zoals endotoxines, of gassen zoals NOx uit de omgeving [5, 6].
In dit onderzoek werd gekeken of het mogelijk was om in water opgeloste vrije en PM-gebonden endotox-
ines te neutraliseren d.m.v. fotokatalyse met TiO2 en UV-licht. Er werden oplossingen bereid met enkel
fijn stof (PM), enkel endotoxine (LPS) en een combinatie van beide (LPS+PM). Om te controleren of
deze stoffen niet gewoon spontaan afgebroken worden na lange duur, werd telkens vergeleken met zuivere
bufferoplossing.
Uit de resultaten (zie figuur 2) bleek duidelijk dat de endotoxines die gebonden waren op fijn stof moei-
lijker werden afgebroken dan de vrije endotoxines. Ook leek de aanwezigheid van fijn stof de biologi-
sche activiteit van de endotoxines te verminderen. De behandeling met TiO2 in combinatie met UV-licht leek het meest efficiënt om endotoxines te neutraliseren, omdat zowel de katalysator TiO2 als de UV-stralen nodig zijn voor het fotokatalytisch proces. De afbraak was zo effectief dat er na veertien uur nog
maar even weinig biologische activiteit werd opgemeten als in de controle zonder PM of LPS.

3 Een mogelijk bindingsmodel tussen fijn stof en endotoxines
Onze uitdaging na de eigenlijke experimenten was om een bindingsmodel te vinden tussen PM en LPS
dat zowel de vaststelling kan verklaren dat PM-gebonden LPS minder gemakkelijk wordt afgebroken, als
de vaststelling dat PM-gebonden LPS minder biologisch actief is. Daarom hebben wij als bindingsmodel
(figuur 3) voorgesteld dat de endotoxines met hun lipide-A gedeelte naar de PM-deeltjes toe gebonden
zijn. Op die manier is het reactieve deel minder beschikbaar om ons immuunsysteem te prikkelen, en
wordt het ook moeilijker afgebroken. De vraag is dan of dit model veralgemeend kan worden voor an-
dere vormen van PM en endotoxine dan de onderzochte vormen, alsook naar andere omgevingen dan
de vloeibare fase waarin het onderzoek gebeurde. Deze binding en interactie is van groot belang om
te weten of het biologisch actieve deel (lipide-A) nog beschikbaar is bij inademing ervan. Enkel op die
manier kunnen de gezondheidseffecten beter voorspeld of gereduceerd worden.

4 Toekomstperspectieven
Dit onderzoek toont aan dat fijn stof een mogelijk neutraliserend effect kan hebben op de activiteit van
endotoxines. Verder onderzoek naar de interactie tussen beide is dus cruciaal. Wat bijvoorbeeld nog
onduidelijk blijft, is of de endotoxines die gebonden zijn aan fijn stof al dan niet beter in het lichaam
opgenomen kunnen worden dan de vrije endotoxi-
nes. Ook kan een beter inzicht in de interactie tussen endotoxines en fijn stof op termijn leiden tot
het ontwikkelen van efficiëntere neutralisatietechnieken voor PM-gebonden endotoxines, bijvoorbeeld in
ventilatiesystemen of op specifieke coatings van gebouwen.

Referenties
[1] J. J. W. Raquel A Silva1. Global premature mortality due to anthropogenic outdoor air pollution and
the contribution of past climate change. Http://iopscience.iop.org/1748-9326/8/3/034005/article.
[2] C. Degobbi, P. H. N. Saldiva, et al. Endotoxin as modifier of particulate matter toxicity: a review of
the literature. Aerobiologia, 2011. 27(2):97–105.
[3] URL http://www.who.int/mediacentre/fact- sheets/fs313/en/.
[4] D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman, 2008. ISBN
071677108X.
[5] URL http://www.elment.nl/nl/techniek/ fotokatalyse.
[6] K. W. Kolasinski. Surface science. WILEY, 2012.

Bibliografie

Referenties
[1] D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman, 2008. ISBN 071677108X.
[2] URL http://bronxbohemian.wordpress.com/2008/10/02/on-a-pelham-bay-isle/img_…).
[3] R. Saito. Analyses and exposure assessment of bacterial endotoxin in agricultural environments. 2008.
[4] M. Fujihara, M. Muroi, et al.
Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by
lipopolysaccharide: roles of the receptor complex. Pharmacol Ther, Nov 2003. 100(2):171–194.
[5] fig. URL http://en.wikibooks.org/wiki/Semiconductors/What_is_a_Semiconductor.
[6] URL http://www.elment.nl/nl/techniek/fotokatalyse.
[7] URL
http://bioamerica-inc.com/v3/index.php?main_page=product_info&cPath=66_…
id=215.
[8] URL http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:1999:163:004….
[9] W. H. Organization et al. Who air quality guidelines for particulate matter, ozone, nitrogen dioxide and
sulfur dioxide. global update 2005, summary of risk assessment. Geneva: WHO, 2006.
[10] elabprotocol. URL http://www.elabprotocols.com/viewer/?id=234.
[11] F. Obbema.
Westerse expats ontvluchten peking door luchtvervuiling,
april 2013.
URL
http://www.demorgen.be/dm/nl/5397/Milieu/article/detail/1607999/2013/04…-
expats-ontvluchten-Peking-door-luchtvervuiling.dhtml.
[12] R. F. Henderson. Clean Air Scientific Advisory Committee (CASAC) Review of the EPA Staff Recommen-
dations Concerning a Potential Thoracic Coarse PM Standard in the Review of the National Ambient Air
Quality Standards for Particulate Matter: Policy Assessment of Scientific and Technical Information (Final
PM OAQPS Staff Paper, EPA-452-R-05-005, June 2005). US Environmental Protection Agency, Office of
the Administrator, Science Advisory Board, 2005.
[13] C. Guastadisegni, F. J. Kelly, et al. Determinants of the proinflammatory action of ambient particulate
matter in immortalized murine macrophages. Environ Health Perspect, Dec 2010. 118(12):1728–1734.
[14] E. Commission et al. April 2004. Second Position Paper on Particulate Matter, 2002.
[15] C. Terzano, F. Di Stefano, et al. Air pollution ultrafine particles: toxicity beyond the lung. Eur Rev Med
Pharmacol Sci, 2010. 14(10):809–21.
[16] A. Valavanidis, K. Fiotakis, et al. Airborne particulate matter and human health: toxicological assessment
and importance of size and composition of particles for oxidative damage and carcinogenic mechanisms.
Journal of Environmental Science and Health, Part C, 2008. 26(4):339–362.
[17] URL http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/.
[18] URL http://www.vmm.be/lucht/luchtvervuilende-stoffen/fijn-stof.
[19] Slonczewski. Microbiology, An Evolving Science, Loose Leaf edition. WW Norton, 2011. ISBN 0393149560.
[20] M. B. Gorbet and M. V. Sefton. Endotoxin: the uninvited guest. Biomaterials, 2005. 26(34):6811–6817.
[21] C. Degobbi, P. H. N. Saldiva, et al. Endotoxin as modifier of particulate matter toxicity: a review of the
literature. Aerobiologia, 2011. 27(2):97–105.
36[22] T. Sandle. Glucans and the bacterial endotoxin test, april 2011.
[23] Endotoxin detection assays.
URL http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/
endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays.aspx.
[24] Lonza. Limulus amebocyte lysate test handleiding.
[25] URL http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=D194C34E-0292-3CCA-E02C-12652….
[26] D. Heumann and T. Roger. Initial responses to endotoxins and gram-negative bacteria. Clin Chim Acta,
Sep 2002. 323(1-2):59–72.
[27] F. B ̈
ackhed F.hed, L. Meijer, et al. Tlr4-dependent recognition of lipopolysaccharide by epithelial cells
requires scd14. Cell Microbiol, Aug 2002. 4(8):493–501.
[28] E. M. Pallson-McDermott and L. A. J. O’Neill. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor,
toll-like receptor-4. Immunology, Oct 2004. 113(2):153–162.
[29] T. Gutsmann, A. B. Schromm, et al. The physicochemistry of endotoxins in relation to bioactivity. Int J
Med Microbiol, Sep 2007. 297(5):341–352.
[30] V. Liebers, M. Raulf-Heimsoth, et al. Health effects due to endotoxin inhalation (review). Arch Toxicol, Apr
2008. 82(4):203–210.
[31] V. Liebers, T. Br ̈
uning, et al. Occupational endotoxin-exposure and possible health effects on humans. Am
J Ind Med, Jun 2006. 49(6):474–491.
[32] C. C. Braun-Fahrl ̈
ander, C.nder, J. Riedler, et al. Environmental exposure to endotoxin and its relation to
asthma in school-age children. N Engl J Med, Sep 2002. 347(12):869–877.
[33] G. Bolte, W. Bischof, et al. Early endotoxin exposure and atopy development in infants: results of a birth
cohort study. Clin Exp Allergy, Jun 2003. 33(6):770–776.
[34] A. Simpson and F. D. Martinez. The role of lipopolysaccharide in the development of atopy in humans. Clin
Exp Allergy, Feb 2010. 40(2):209–223.
[35] A. R. Osornio-Vargas, J. Serrano, et al. In vitro biological effects of airborne pm2.5 and pm10 from a
semi-desert city on the mexico-us border. Chemosphere, Apr 2011. 83(4):618–626.
[36] A. R. Osornio-Vargas, J. C. Bonner, et al. Proinflammatory and cytotoxic effects of mexico city air pollution
particulate matter in vitro are dependent on particle size and composition. Environ Health Perspect, Aug
2003. 111(10):1289–1293.
[37] N. Manzano-Leon, R. Quintana, et al. Variation in the composition and in vitro proinflammatory effect of
urban particulate matter from different sites. J Biochem Mol Toxicol, 2013. 27(1):87–97.
[38] W. Anderson, P. Huck, et al. Endotoxin inactivation in water by using medium-pressure uv lamps. Applied
and environmental microbiology, 2003. 69(5):3002–3004.
[39] Y. Shi, H. HogenEsch, et al. Detoxification of endotoxin by aluminum hydroxide adjuvant. Vaccine, Feb
2001. 19(13-14):1747–1752.
[40] J. M. Bates, J. Akerlund, et al. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents
inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell host & microbe, 2007. 2(6):371–382.
37[41] L. Cascales, C. Mas-Moruno, et al. Tiratricol neutralizes bacterial endotoxins and reduces lipopolysaccharide-
induced tnf-α production in the cell. Chemical Biology & Drug Design, 2008. 72(4):320–328.
[42] K. W. Kolasinski. Surface science. WILEY, 2012.
[43] K. Sunada, Y. Kikuchi, et al. Bactericidal and detoxification effects of tio2 thin film photocatalysts. Envi-
ronmental science & technology, 1998. 32(5):726–728.
[44] I. R. P. Clett Erridge, Elliott Bennett-Guerrero. Structure and function of lipopolysaccharides. Microbes
and Infection, 2002.
[45] M. Smits, F. Vanpachtenbeke, et al. Effect of operating and sampling conditions on the exhaust gas compo-
sition of small-scale power generators. PLoS One, 2012. 7(3):e32825.
[46] Guidance for industry, pyrogen and endotoxins testing: Questions and answers, June 2012. URL http://www.
fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM310098.pdf.
[47] M. RafieeTehrani and H. Khoshbooii. Inhibiting effect of various cations on endotoxin assay with the Limulus
amoebocyte lysate chromogenic substrate method. Pharmazeutische Industrie, 1996. 58(11):1042–1045.
[48] P. Duquenne, G. Marchand, et al. Measurement of endotoxins in bioaerosols at workplace: a critical review
of literature and a standardization issue. Ann Occup Hyg, Mar 2013. 57(2):137–172.
[49] URL http://www.gea-airtreatment.com/Halfgeleider-productie.217.0.html?&L=11.
[50] URL http://www.vccn.nl/default.asp?id=1027&cat=Encyclopedie.
[51] URL http://www.eea.europa.eu/themes/air/intro.
[52] M. Adams and A. Lukewille. The European environment: state and outlook 2010 Air pollution. European
Environment Agency, 2010.
[53] URL http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/index.html.
[54] dossier fijn stof: meten, Januari 2013. URL http://www.rivm.nl/Onderwerpen/Onderwerpen/F/Fijn_
stof/Meten.
[55] M. Mampaey. Veelbelovende nieuwe manier om gezondheidseffect luchtvervuiling te bepalen. URL http:
//www.medischmilieukundignetwerk.be/defaultSubsite.aspx?id=29729#.UYKf5fk….
[56] M. L. Bell and K. Ebisu. Environmental inequality in exposures to airborne particulate matter components
in the united states. Environmental health perspectives, 2012. 120(12):1699.
[57] P. S. Thorne, R. D. Cohn, et al. Predictors of endotoxin levels in us housing. Environmental health perspec-
tives, 2009. 117(5):763.
[58] P. Tripathi, A. Beaussart, et al. Adhesion and nanomechanics of pili from the probiotic lactobacillus rham-
nosus gg. ACS Nano, Apr 2013. 7(4):3685–3697.
[59] G. Francius, D. Alsteens, et al. Stretching polysaccharides on live cells using single molecule force spec-
troscopy. Nat Protoc, 2009. 4(6):939–946.
[60] G. Francius, S. Lebeer, et al. Detection, localization, and conformational analysis of single polysaccharide
molecules on live bacteria. ACS Nano, Sep 2008. 2(9):1921–1929.
[61] D. A. Beeldens. Fotokatalyse: Een toekomsttechniek? Onderzoekscentrum voor de Wegenbouw.
38[62] Januari
2013.
URL
http://www.cdenv.be/actua/nieuwe-test-met-luchtzuiverend-cement-
brusselse-leopold-ii-tunnel.
[63] J. R. Elisa Cabiscol, Jordi Tamarit. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen
species (review), 1999.
[64] URL http://www.kristofvaes.be/.
[65] URL http://www.vmm.be/lucht/meetresultaten/fijn-stof.