Multifunctional Polymer Hybrid Nanoparticles for Biomedical Applications

Martijn

Peters

Multifunctionele nanopartikels: Een blik in de toekomst van de medische wereld

Martijn Peters, Universiteit Hasselt, België

Gedurende deze studie in het Instituut voor Materiaal Onderzoek aan de Universiteit Hasselt werd er onderzoek gedaan naar de ontwikkeling van nieuwe procedures/materialen welke de synthese van geavanceerde nanopartikel modellen vergemakkelijken. Zo werd er gezocht naar een nieuwe mogelijkheid om het gebruik van ingewikkelde en tijdrovende procedures, nodig voor deeltjes te voorzien van chemische aanhechtingsgroepen op hun oppervlak, overbodig te maken. Ook werd er gekeken naar het inbouwen van fluorescentie in nanopartikels, zodat deze kunnen gevisualiseerd worden zonder inkapseling van potentieel toxische stoffen die de menselijke gezondheid kunnen schaden.

Hoewel nanotechnologie al onbewust werd toegepast in de 9de eeuw door Mesopotamiërs tijdens het maken van ‘fonkelende’ kruiken, wordt het beschouwd als het platform dat een grote evolutie zal teweegbrengen in alle takken van de wetenschap in de komende decennia. Zoals nobelprijs laureaat Richard Feynman immers zei: “Er is nog veel ruimte daar beneden”. Eén van de bekendste instrumenten in het veld zijn de nanopartikels, deeltjes in dezelfde grootteorde als antilichamen en virussen. Het gebruik van de deeltjes in de medische wetenschappen heeft al voor veel doorbraken gezorgd en het veld evolueert op een steeds sneller tempo. Een bekende applicatie is het gebruik van zink oxide nanopartikels in zonnecrème voor bescherming tegen UV-geïnduceerde huidkanker. Voor meer ingewikkelde toepassingen, zoals doelgerichte medicijn aflevering, zijn de hedendaags gebruikte modellen echter te simplistisch. Een oplossing is de ontwikkeling van multifunctionele modellen die door hun opbouw meerdere functies tegelijk kunnen vervullen. Zo kan een deeltje bijvoorbeeld medicijnen bevatten, bedekt zijn met specifieke herkennings-groepen voor het lokaliseren van een zieke cel en ingekapselde visualisatie middelen dragen zodat ze overal gevolgd kunnen worden. Het grote struikelblok is echter de tijd- en geld-rovend conversie van theoretische modellen naar bruikbare toepassingen. Daarom was het doel van dit onderzoek om deze ontwikkeling te vergemakkelijken en naar een hoger niveau te tillen.

Allereerst werd er gekeken naar het inbouwen van chemische koppelingsgroepen op het oppervlakte van deeltjes. Deze zijn vereist voor het aanhechten van biologische structuren die de interactie met de omgeving bepalen (stabiliteit, opname, specificiteit, etc.) en daardoor onmisbaar zijn in zowat elke medische toepassing. Er bestaan materialen, zoals ijzeroxide, waarbij een gemakkelijke aanhechting mogelijk is. Maar deze kan echter verbroken worden bij extensieve wasstappen en de mogelijke toxiciteit van de deeltjes is nog steeds een discussiepunt. Een oplossing voor het toxiciteitsprobleem is het gebruik van polymeren als basismateriaal voor de opbouw van de nanodeeltjes. De polymeren zelf bevatten meestal geen chemische koppelingsgroepen, waardoor deze ingebouwd moeten worden. Het vaakst gebeurt dit na de synthese van de deeltjes via ingewikkelde, tijdrovende en inefficiënte procedures. Deze studie stelde een nieuwe manier voor om de gewenste groepen tijdens de synthese van de deeltjes in te bouwen. Een voordeel is dat de synthese in water gebeurt waardoor het zowel goed voor het milieu als de portefeuille is. Ook werden er al multifunctionele nanopartikels gemaakt als ‘proof of concept’. De oppervlakte van de polymere nanodeeltjes werd bedekt met een netwerk van warmtegevoelige polymeer-strengen welke de eigenschap hebben om boven een bepaalde temperatuurdrempel samen te krimpen. Dit kan gebruikt worden om medicijnen te laden welke uit het netwerk worden vrijgezet wanneer de deeltjes verhit worden. Op deze manier kunnen de ‘slimme’ nanodeeltjes bijvoorbeeld worden ingezet om medicijnen af te leveren bij lokale infecties waar de temperatuur hoger is dan in de rest van het lichaam. In deze studie werden er in de plaats van medicijnen zilveren nanopartikels ingebouwd die de eigenschap hebben antimicrobieel en niet-toxisch voor het menselijk lichaam te zijn. Zo zijn ze werkzaam tegen de multiresistente bacterie MRSA, kunnen ze HIV-1 infectie blokkeren, hebben ze effect op hepatitis B en zijn ze daarbovenop ook voorzien van een zeer potente antischimmel werking. De deeltjes zijn hierdoor erg aantrekkelijk voor gebruik in coatings in medische omgevingen ter preventie van medicijnresistente ziektekiemen of schimmel overdracht. Ook werden al eerste stappen gezet in de richting van een nanodeeltje waarop antilichamen of peptiden kunnen gehecht worden voor het doelgericht zoeken van bepaalde celgroepen.

Vervolgens werd er gekeken naar het inbouwen van een visualisatie-eigenschap in de nanopartikels zonder extra producten in te kapselen. De mogelijkheid om nanodeeltjes te volgen doorheen het lichaam is van groot belang voor het beter begrijpen van cellulaire processen, het effect van therapieën en de interactie van de deeltjes met het menselijk lichaam. Er werden nanopartikels ontwikkeld bestaande uit het halfgeleidend polymeer MDMO-PPV wat een lage kostprijs heeft, goede optische eigenschappen bezit en mogelijk niet toxisch is. Door het gebruik van dit materiaal zijn de nanodeeltjes zelf-fluorescerend. Ook hier werd er een multifunctioneel model ontwikkeld bestaande uit twee halve delen. Eén helft was het fluorescerend polymeer MDMO-PPV, de andere het biodegradeerbaar polymeer PLLA. PLLA kan gebruikt worden voor het inkapselen van medicijnen, die na verloop van tijd worden vrijgezet in het lichaam, en voor het aanhechten van biologische moleculen. Er werd ook magnetiet ingekapseld in het MDMO-PPV gedeelte, wat gevoelig is voor extern aangelegde elektrische velden. Deze eigenschap is handig voor medische doeleinden. Zo kan het magnetiet gebruikt worden voor bepaalde celgroepen te elimineren door middel van hyperthermie, het genereren van hoge temperatuur door een hoogfrequent magnetisch veld. De toepassing vindt zijn oorsprong in een beroemde uitspraak van Hippocrates (460-370BC): “De ziekte die niet genezen kan worden door koorts kan beschouwd worden als ongeneesbaar”. Een andere mogelijkheid is dat magnetiet gebruikt wordt om de nanodeeltjes te leiden doorheen het lichaam met magnetische velden. Studies werden uitgevoerd met deze nanopartikels waarvan de eerste resultaten indiceerde dat ze niet toxisch zijn voor menselijke cellen.

In dit onderzoek werden enkele belangrijke stappen in de richting van geavanceerde medische nanopartikel modelontwikkeling gezet door het op punt stellen van een nieuwe synthesetechniek die rechtstreeks chemische structuren inbouwt nodig voor het koppelen van relevante groepen en door de introductie van nanopartikels opgebouwd uit een nieuw fluorescerend materiaal wat het inkapselen van visualisatiegroepen overbodig maakt.

Bibliografie

1. Feynman RP. The pleasure of finding things out: The best short works of Richard P. Feynman: Basic Books; 2005.2. TC P, Mathew L, Chandrasekaran N, Raichur AM, Mukherjee A. Biomimetic Synthesis of Nanoparticles: Science, Technology & Applicability.3. Sanvicens N, Marco MP. Multifunctional nanoparticles--properties and prospects for their use in human medicine. Trends in Biotechnology. 2008; 26(8): 425-33.4. Sperling R, Parak W. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 2010; 368(1915): 1333-83.5. Soenen SJ, Rivera-Gil P, Montenegro J-M, Parak WJ, De Smedt SC, Braeckmans K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 2011; 6(5): 446-65.6. Alkilany AM, Murphy CJ. Toxicity and cellular uptake of gold nanoparticles: what we have learned so far? Journal of nanoparticle research : an interdisciplinary forum for nanoscale science and technology. 2010; 12(7): 2313-33.7. Nahar M, Dutta T, Murugesan S, Asthana A, Mishra D, Rajkumar V, et al. Functional polymeric nanoparticles: an efficient and promising tool for active delivery of bioactives. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 2006; 23(4): 259-318.8. Puri S. Novel Functionalized Polymers for Nanoparticle Formulations with Anti Cancer Drugs. PhD Thesis University of Nottingham. 2007.9. Patil YB, Toti US, Khdair A, Ma L, Panyam J. Single-step surface functionalization of polymeric nanoparticles for targeted drug delivery. Biomaterials. 2009; 30(5): 859-66.10. Barner L, Quick AS, Vogt AP, Winkler V, Junkers T, Barner-Kowollik C. Thermally responsive core-shell microparticles and cross-linked networks based on nitrone chemistry. Polymer Chemistry. 2012; 3(8): 2266-76.11. Riehemann K, Schneider SW, Luger TA, Godin B, Ferrari M, Fuchs H. Nanomedicine--challenge and perspectives. Angewandte Chemie. 2009; 48(5): 872-97.12. Weiss KC, Lorenz RM, Landfester K, Mailänder V. Cellular Uptake Behavior of Unfunctionalized and Functionalized PBCA Particles Prepared in a Miniemulsion Macromolecular Bioscience. 2007; 7: 883-96.13. D'Olieslaeger L. Multifunctional Hybrid Nanoparticles for Biomedical Applications UHasselt; 2012.14. Bera D, Qian L, Tseng T-K, Holloway PH. Quantum Dots and Their Multimodal Applications: A Review. Materials. 2010; 3(4): 2260-345.15. Facchetti A. π-Conjugated Polymers for Organic Electronics and Photovoltaic Cell Applications†. Chemistry of Materials. 2010; 23(3): 733-58.16. Jarzab D, Lu M, Nicolai HT, Blom PWM, Loi MA. Photoluminescence of conjugated polymer blends at the nanoscale. Soft Matter. 2011; 7(5): 1702-7.17. Green M, Howes P, Berry C, Argyros O, Thanou M. Simple conjugated polymer nanoparticles as biological labels. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Science. 2009; 465(2109): 2751-9.18. Tuncel D, Demir HV. Conjugated polymer nanoparticles. Nanoscale. 2010; 2(4): 484-94.19. Wong EHH, Junkers T, Barner-Kowollik C. Nitrones in synthetic polymer chemistry. Polymer Chemistry. 2011; 2(5): 1008-17.20. Zang L, Wong EHH, Barner-Kowollik C, Junkers T. Control of methyl methacrylate radical polymerization via Enhanced Spin Capturing Polymerization (ESCP). Polymer. 2010; 51(17): 3821-5.4021. Costello PA, Martin IK, Slark AT, Sherrington DC, Titterton A. Branched methacrylate copolymers from multifunctional monomers: chemical composition and physical architecture distributions. Polymer. 2002; 43(2): 245-54.22. Goldmann AS, Walther A, Nebhani L, Joso R, Ernst D, Loos K, et al. Surface Modification of Poly(divinylbenzene) Microspheres via Thiol−Ene Chemistry and Alkyne−Azide Click Reactions. Macromolecules. 2009; 42(11): 3707-14.23. Cormack PAG, Davies A, Fontanals N. Synthesis and characterization of microporous polymer microspheres with strong cation-exchange character. Reactive and Functional Polymers. 2012; 72(12): 939-46.24. Durmaz YY, Karagoz B, Bicak N, Demirkol DO, Yalcinkaya EE, Timur S, et al. Modification of polydivinylbenzene microspheres by a hydrobromination/click-chemistry protocol and their protein-adsorption properties. Macromolecular Bioscience. 2011; 11(1): 141-50.25. Mittal V. Miniemulsion Polymerization Technology: Wiley; 2011.26. Schubert S, Delaney JJT, Schubert US. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 2011; 7(5): 1581-8.27. Kotti K, Kiparissides C. Synthesis of Composite Polystyrene/Silica Nanoparticles via Precipitation and Emulsion Polymerization Methods. Macromolecular Reaction Engineering. 2010; 4(5): 347-57.28. Elbert DL. Liquid-liquid two-phase systems for the production of porous hydrogels and hydrogel microspheres for biomedical applications: A tutorial review. Acta Biomaterialia. 2011; 7(1): 31-56.29. Ethirajan A, Landfester K. Functional hybrid materials with polymer nanoparticles as templates. Chemistry. 2010; 16(31): 9398-412.30. Landfester K. Polyreactions in Miniemulsions. Macromolecular Rapid Communications. 2001; 22(12): 896-936.31. Lu Y, Mei Y, Drechsler M, Ballauff M. Thermosensitive core-shell particles as carriers for ag nanoparticles: modulating the catalytic activity by a phase transition in networks. Angewandte Chemie. 2006; 45(5): 813-6.32. Lara HH, Garza-Trevino EN, Ixtepan-Turrent L, Singh DK. Silver nanoparticles are broad-spectrum bactericidal and virucidal compounds. Journal of Nanobiotechnology. 2011; 9: 30.33. Lara HH, Ayala-Nunez NV, Ixtepan-Turrent L, Rodriguez-Padilla C. Mode of antiviral action of silver nanoparticles against HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 2010; 8: 1.34. Panacek A, Kolar M, Vecerova R, Prucek R, Soukupova J, Krystof V, et al. Antifungal activity of silver nanoparticles against Candida spp. Biomaterials. 2009; 30(31): 6333-40.35. de Mol NJ, Fischer MJ. Surface plasmon resonance: a general introduction. Methods in Molecular Biology. 2010; 627: 1-14.36. Thomas III S, Swager T. Conjugated Polymer Sensors: Design Principles Towards Enhanced Versatility. DTIC Document, 2004.37. Brabec C, Cravino A, Zerza G, Sariciftci N, Kiebooms R, Vanderzande D, et al. Photoactive Blends of Poly (p ara-phenylenevinylene)(PPV) with Methanofullerenes from a Novel Precursor: Photophysics and Device Performance. The Journal of Physical Chemistry B. 2001; 105(8): 1528-36.38. Peeters M, Troost FJ, van Grinsven B, Horemans F, Alenus J, Murib MS, et al. MIP-based biomimetic sensor for the electronic detection of serotonin in human blood plasma. Sensors and Actuators B: Chemical. 2012; 171–172(0): 602-10.39. Vandenbergh J, Cosemans I, Lutsen L, Vanderzande D, Junkers T. Controlled synthesis of MDMO-PPV and block copolymers made thereof. Polymer Chemistry. 2012; 3(7): 1722-5.40. Ethirajan A, Musyanovych A, Chuvilin A, Landfester K. Biodegradable Polymeric Nanoparticles as Templates for Biomimetic Mineralization of Calcium Phosphate. Macromolecular Chemistry and Physics. 2011; 212(9): 915-25.4141. Landfester K. Miniemulsion polymerization and the structure of polymer and hybrid nanoparticles. Angewandte Chemie. 2009; 48(25): 4488-507.42. Cooreman P, Thoelen R, Manca J, vandeVen M, Vermeeren V, Michiels L, et al. Impedimetric immunosensors based on the conjugated polymer PPV. Biosensors and Bioelectronics. 2005; 20(10): 2151-6.43. Ghazy O. Binary Blend Nanoparticles with Defined Morphology; 2008.44. Chen YC, Dimonie V, El-Aasser MS. Effect of interfacial phenomena on the development of particle morphology in a polymer latex system. Macromolecules. 1991; 24(13): 3779-87.45. Jiang S, Chen Q, Tripathy M, Luijten E, Schweizer KS, Granick S. Janus particle synthesis and assembly. Advanced materials. 2010; 22(10): 1060-71.46. Xu H, Deshmukh R, Timmons R, Nguyen KT. Enhanced endothelialization on surface modified poly(L-lactic acid) substrates. Tissue Engineering Part A. 2011; 17(5-6): 865-76.47. Zeronian SH, Collins MJ. Surface modification of polyester by alkaline treatments. Textile Progress. 1989; 20(2): 1-26.48. Jeong U, Teng X, Wang Y, Yang H, Xia Y. Superparamagnetic Colloids: Controlled Synthesis and Niche Applications. Advanced Materials. 2007; 19(1): 33-60.49. Pankhurst QA, Connolly J, Jones SK, Dobson J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 2003; 36(13): R167.50. McBain SC, Yiu HH, Dobson J. Magnetic nanoparticles for gene and drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 2008; 3(2): 169-80.51. Fernández-Pacheco R, Valdivia JG, Ibarra MR. Magnetic Nanoparticles for Local Drug Delivery Using Magnetic Implants. In: Foote RS, Lee JW, editors. Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology™. 544: Humana Press; 2009. p. 559-69.52. Yellen BB, Forbes ZG, Halverson DS, Fridman G, Barbee KA, Chorny M, et al. Targeted drug delivery to magnetic implants for therapeutic applications. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2005; 293(1): 647-54.53. Rosengart AJ, Kaminski MD, Chen H, Caviness PL, Ebner AD, Ritter JA. Magnetizable implants and functionalized magnetic carriers: A novel approach for noninvasive yet targeted drug delivery. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2005; 293(1): 633-8.54. Angell JJ. Synthesis and Characterization of CdSe-ZnS Core-Shell Quantum Dots for Increased Quantum Yield. 2011.55. van Breemen AJJM, Vanderzande DJM, Adriaensens PJ, Gelan JMJV. Highly Selective Route for Producing Unsymmetrically Substituted Monomers toward Synthesis of Conjugated Polymers Derived from Poly(p-phenylene vinylene). The Journal of Organic Chemistry. 1999; 64(9): 3106-12.56. Urban M, Musyanovych A, Landfester K. Fluorescent Superparamagnetic Polylactide Nanoparticles by Combination of Miniemulsion and Emulsion/Solvent Evaporation Techniques. Macromolecular Chemistry and Physics. 2009; 210(11): 961-70.57. Berne BJ, Pecora R. Dynamic Light Scattering: With Applications to Chemistry, Biology and Physics: DOVER PUBN Incorporated; 2000.58. Reimer L, Kohl H. Transmission Electron Microscopy: Physics of Image Formation and Microanalysis: Springer; 2008.59. Goldstein J. Scanning electron microscopy and x-ray microanalysis: Kluwer Academic/Plenum Publishers; 2003.60. Griffiths PR, de Haseth JA. Attenuated Total Reflection. Fourier Transform Infrared Spectrometry: John Wiley & Sons, Inc.; 2006. p. 321-48.61. Upstone SL. Ultraviolet/Visible Light Absorption Spectrophotometry in Clinical Chemistry. In: Meyers RA, editor. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Chichester: John Wiley & Sons Ltd; 2000.62. An Introduction to Fluorescence Spectroscopy PerkinElmer Ltd; 2000.63. Boyle J. Molecular biology of the cell, 5th edition by B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and P. Walter. Biochemistry and Molecular Biology Education. 2008; 36(4): 317-8.4264. Shapiro HM. Practical Flow Cytometry: Wiley; 2005.65. Combs CA. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 2010: 2.1. -2.1. 14.66. Petty HR. Fluorescence microscopy: Established and emerging methods, experimental strategies, and applications in immunology. Microscopy Research and Technique. 2007; 70(8): 687-709.67. G-Biosciences. Protein Cross-Linkers: Handbook & Selection Guide.68. Ethirajan A, Baeten L, Conradi M, Ranieri K, Conings B, Boyen H-G, et al. UV-induced functionalization of poly(divinylbenzene) nanoparticles via efficient [2 + 2]-photocycloadditions. Polymer Chemistry. 2013.69. Choi EC, Jin SM, Park YJ, Kim Y. Polymerization kinetics for the preparation of poly (< i> p</i>-divinylbenzene) via a miniemulsion polymerization process. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers. 2008; 39(5): 483-8.70. http://www.biolar.lv/web/en/22-azobisisobutyronitrile-aibn.html: biolar; [01/06/2013].71. Bach T. Stereoselective intermolecular [2+2]-photocycloaddition reactions and their application in synthesis. Synthesis. 2000; 1998(05): 683-703.72. Zhang J, Peppas NA. Molecular interactions in poly (methacrylic acid)/poly (N‐isopropyl acrylamide) interpenetrating polymer networks. Journal of applied polymer science. 2001; 82(5): 1077-82.73. Mulfinger L, Solomon SD, Bahadory M, Jeyarajasingam AV, Rutkowsky SA, Boritz C. Synthesis and study of silver nanoparticles. Journal of Chemical Education. 2007; 84(2): 322.74. Puchalski M, Dąbrowski P, Olejniczak W, Krukowski P, Kowalczyk P, Polański K. The study of silver nanoparticles by scanning electron microscopy, energy dispersive X-ray analysis and scanning tunnelling microscopy. Materials Science-Poland. 2007; 25(2): 473-8.75. Wang C, Yan Q, Liu H-B, Zhou X-H, Xiao S-J. Different EDC/NHS activation mechanisms between PAA and PMAA brushes and the following amidation reactions. Langmuir. 2011; 27(19): 12058-68.76. Lee JY, Lee J-W, Schmidt CE. Neuroactive conducting scaffolds: nerve growth factor conjugation on active ester-functionalized polypyrrole. Journal of the Royal Society Interface. 2009; 6(38): 801-10.77. Lomant AJ, Fairbanks G. Chemical probes of extended biological structures: Synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S] dithiobis (succinimidyl propionate). Journal of Molecular Biology. 1976; 104(1): 243-61.78. Staros JV, Wright RW, Swingle DM. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 1986; 156(1): 220-2.79. Cuatrecasas P, Parikh I. Adsorbents for affinity chromatography. Use of N-hydroxysuccinimide esters of agarose. Biochemistry. 1972; 11(12): 2291-9.80. Van Severen I, Breselge M, Fourier S, Adriaensens P, Manca J, Lutsen L, et al. 2,5-Substituted PPV-Derivatives with Different Polarities: The Effect of Side Chain Polarity on Solubility, Optical and Electronic Properties. Macromolecular Chemistry and Physics. 2007; 208(2): 196-206.81. Cosemans I, Wouters J, Cleij T, Lutsen L, Maes W, Junkers T, et al. Living Polymerization via Anionic Initiation for the Synthesis of Well-Defined PPV Materials. Macromolecular Rapid Communications. 2012; 33(3): 242-7.82. Sigma-Aldrich. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/546461?lang=en&regi… [02/06/2013].83. Lockwood DJ, Mascher P. Nanoscale Luminescent Materials: Electrochemical Society; 2010.4384. Chambon S, Rivaton A, Gardette J-L, Firon M, Lutsen L. Aging of a donor conjugated polymer: Photochemical studies of the degradation of poly[2-methoxy-5-(3′,7′-dimethyloctyloxy)-1,4-phenylenevinylene]. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 2007; 45(2): 317-31.85. Krebs FC. Stability and Degradation of Organic and Polymer Solar Cells: Wiley; 2012.86. Psiachos D, Mazumdar S. Correlated-electron description of the photophysics of thin films of π-conjugated polymers. Physical Review B. 2009; 79(15): 155106.87. Kong B, Seog JH, Graham LM, Lee SB. Experimental considerations on the cytotoxicity of nanoparticles. Nanomedicine. 2011; 6(5): 929-41.88. Dobrovolskaia MA, Clogston JD, Neun BW, Hall JB, Patri AK, McNeil SE. Method for analysis of nanoparticle hemolytic properties in vitro. Nano Letters. 2008; 8(8): 2180-7.