Naar een algemene synthesestrategie voor het genereren van pseudodesmine A analogen

Matthias

De Vleeschouwer

Ziekenhuisbacterie ten dode opgeschreven door komst nieuwe antibiotica?

Dit jaar werd aan de Universiteit Gent een efficiënte methode ontwikkeld om een nieuw en krachtig antibioticum te maken dat definitief komaf kan maken met de ziekenhuisbacterie. Een geautomatiseerde syntheseroute werd recent op punt gesteld zodat deze veelbelovende, maar complexe moleculen zeer snel en efficiënt kunnen geproduceerd worden. De antibiotische werking van deze moleculen blijkt essentieel verschillend van de huidige antibiotica waardoor verwacht wordt dat de ziekenhuisbacterie ditmaal geen resistentie zal kunnen ontwikkelen.

Nu de levensverwachting steeds verder toeneemt is de kans groot dat we ooit in een zieken‐ of bejaardenhuis in aanraking komen met deze bacterie. De reden dat het zo een angstaanjagende bacterie is, komt voort uit het feit dat ze zich zo snel verspreid en moeilijk te behandelen is. Ze geeft aanleiding tot infecties die vooral bij verzwakte patiënten veel schade berokkenen. In België alleen kunnen jaarlijks bijna 3.000 sterfgevallen rechtstreeks hieraan toegewezen worden en men verwacht dat dit alleen maar zal toenemen.

De veelbelovende molecule heet pseudodesmine en wordt aangemaakt door bacteriën die leven in het slijmvlies van de black belly salamander. Testen tonen aan dat pseudodesmine A activiteit vertoont tegen verschillende soorten bacteriën, waaronder ook bacteriën die resistent geworden zijn tegen antibiotica. Het onrechtmatig gebruik van antibiotica geeft de bacteriën immers het signaal om kleine wijzigingen aan te brengen in de doelproteïnen waartegen deze antibiotica gericht zijn. Op die manier stijgen de kansen van de sterkste en meest inventieve bacteriën, Darwins survival of the fittest principe in het achterhoofd, met resistentie als gevolg.

De werking van de pseudodesmines is echter essentieel verschillend. Eerder dan in te werken op één specifiek eiwit vallen zij het gehele omhulsel van de bacterie aan: het celmembraan. Dit membraan bestaat al miljoenen jaren in dezelfde vorm en is een essentieel onderdeel van de cel. Het fysieke uiterlijk en de chemische opbouw hiervan kan dan ook niet zomaar gewijzigd worden. Hierdoor denkt men dan ook dat bacteriën niet resistent kunnen worden tegen antibiotica van het pseudodesmine type.

Pseudodesmine heeft zijn antibiotische werking te danken aan het vermogen om zich op een bijzondere wijze op elkaar te stapelen wanneer het zich in een welbepaalde omgeving bevindt. Binnenin een celmembraan heerst een uiterst apolaire of watervrezende omgeving. Dit vormt voor de individuele moleculen het signaal om zich samen op een specifieke wijze te ordenen zodat een groter geheel of ‘supramoleculaire’ structuur gevormd wordt, dat de vorm heeft van een microscopische kanaal of porie. Zo ontstaan op verschillende plaatsen poriën in de beschermlaag van de bacteriële cel. Door deze poriën komt een ongecontroleerd transport van kleine ionen tot stand zoals H+, K+ en Ca2+. Eenmaal binnen de cel veroorzaken deze een heuse kettingreactie aan processen waardoor de cel uiteindelijk afsterft. Men kan de werking van deze antibiotica vergelijken met een muskusrat die gangen graaft in de dijk (celmembraam) rondom een dorp (cel), waarbij het gevaar bestaat dat het dorp onderloopt zodra er te veel tunnels in de dijken gegraven zijn.

Helaas kan men deze nieuwe soort antibiotica nog niet meteen op de markt verwachten, omdat er eerst talloze testen uitgevoerd moeten worden. Deze vereisen echter een grote hoeveelheid pseudodesmine. Men zou hiertoe een klopjacht kunnen opstarten naar de salamanders en hun gastbacteriën, waaruit men na veel moeite pseudodesmine kan isoleren. Dit is evenwel een erg omslachtige procedure die heel veel tijd en arbeid vereist en later sowieso niet opschaalbaar is voor productie. Bovendien is het vaak nuttig aan de structuur te sleutelen om de werking te optimaliseren.

Daarom werd dit jaar aan de Universiteit Gent een efficiënte manier ontwikkeld om in korte tijd zowel het pseudodesmine als analogen ervan te maken. Analogen zijn verbindingen die zeer goed lijken op de originele molecule maar op één plaats een licht gewijzigde structuur hebben. Deze kunnen eveneens getest worden als potentieel antibioticum met als voordeel dat hierdoor een verbeterde versie ontwikkeld kan worden.

Matthias De Vleeschouwer: “Tijdens mijn masterproef is een efficiënte syntheseroute ontwikkeld die grotendeels geautomatiseerd verloopt. In slechts een week tijd kan een molecule met dergelijke complexe structuur uit eenvoudigere bouwstenen gemaakt worden. Deze werden vervolgens verder onderzocht met behulp van magnetische resonantie spectroscopie. Net zoals bij de MRI scanners in ziekenhuizen, kan men hiermee een gedetailleerd beeld van de molecule opstellen. We stelden daarbij ook vast dat kleine wijzigingen in de structuur een grote invloed kunnen hebben op het gedrag en dus ook de activiteit van de analogen.”

Deze interessante resultaten vormen nu het uitgangspunt voor een doctoraatsonderzoek op pseudodesmine en analogen, dat gesponsord wordt door het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen in de hoop op termijn een nieuw en krachtig antibioticum te ontwikkelen dat hopelijk korte metten kan maken met de ziekenhuisbacterie.”

Bibliografie

1. Nybroe, O. and J. Sorensen, Production of cyclic lipopeptides by fluorescent pseudomonads.
pseudomonas, 2004. 3: p. 147-162.
2. Sinnaeve, D., Gevorderde Structuuranalyse van een Recent Geïsoleerd Natuurproduct met
Behulp van NMR Spectroscopie 2005, licentiaatsthesis, Universiteit Gent.
3. Sinnaeve, D., et al., Structure and X-ray conformation of pseudodesmins A and B, two new
cyclic lipodepsipeptides from Pseudomonas bacteria. Tetrahedron, 2009. 65(21): p. 4173-
4181.
4. Sinnaeve, D., Characterisation of the structure and self-assembly of a small cyclic peptide. An
analysis using NMR spectroscopy, diffusion and heteronuclear relaxation measurements.
2010, PhD thesis, Universiteit Gent.
5. Sinnaeve, D., et al., The Solution Structure and Self-Association Properties of the Cyclic
Lipodepsipeptide Pseudodesmin A Support Its Pore-Forming Potential. Chemistry-a European
Journal, 2009. 15(46): p. 12653-12662.
6. Malinowska, A., Solid Phase Synthesis of cyclolipodepsipeptide, in Laboratory for Organic
and Biomimetic Chemistry. 2009, Universiteit Gent.
7. Zasloff, M., Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature, 2002. 415(6870): p.
389-395.
8. Brogden, K.A., Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?
Nature Reviews Microbiology, 2005. 3(3): p. 238-250.
9. Reddy, K.V.R., R.D. Yedery, and C. Aranha, Antimicrobial peptides: premises and promises.
International Journal of Antimicrobial Agents, 2004. 24(6): p. 536-547.
10. Montesinos, E., Antimicrobial peptides and plant disease control. Fems Microbiology Letters,
2007. 270(1): p. 1-11.
11. Raaijmakers, J.M., et al., Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas:
more than surfactants and antibiotics. Fems Microbiology Reviews, 2010. 34(6): p. 1037-
1062.
12. Roongsawang, N., K. Washio, and M. Morikawa, Diversity of Nonribosomal Peptide
Synthetases Involved in the Biosynthesis of Lipopeptide Biosurfactants. International Journal
of Molecular Sciences, 2011. 12(1): p. 141-172.
13. Raaijmakers, J.M., I. de Bruijn, and M.J.D. de Kock, Cyclic lipopeptide production by plantassociated
Pseudomonas spp.: Diversity, activity, biosynthesis, and regulation. Molecular
Plant-Microbe Interactions, 2006. 19(7): p. 699-710.
14. Gross, H. and J.E. Loper, Genomics of secondary metabolite production by Pseudomonas spp.
Natural Product Reports, 2009. 26(11): p. 1408-1446.
15. Hutchison, M.L., M.A. Tester, and D.C. Gross, Role of biosurfectant and ion channel-forming
activities of syringomycin in transmembrane ion flux - A model for the mechanism of action in
the plant-pathogen interaction. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1995. 8(4): p. 610-620.
16. Bender, C.L., F. Alarcon-Chaidez, and D.C. Gross, Pseudomonas syringae phytotoxins: Mode
of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide synthetases. Microbiology
and Molecular Biology Reviews, 1999. 63(2): p. 266-+.
17. Coraiola, M., et al., WLIP and tolaasin I, lipodepsipeptides from Pseudomonas reactans and
Pseudomonas tolaasii, permeabilise model membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-
Biomembranes, 2006. 1758(11): p. 1713-1722.
18. Lo Cantore, P., et al., Biological characterization of white line-inducing principle (WLIP)
produced by Pseudomonas reactans NCPPB1311. Molecular Plant-Microbe Interactions,
2006. 19(10): p. 1113-1120.
19. Mortishiresmith, R.J., et al., Determination of the structure of an extracellular peptide
produced by the mushroom saprotroph Pseudomonas reactans. Tetrahedron, 1991. 47(22): p.
3645-3654.
20. AUSTIN, R., M., Jr., et al., Antibiotics from bacteria isolated from amphibian skin. 2002.
21. Burke, T.R., M. Knight, and B. Chandrasekhar, Solid-phase synthesis of viscosin, a cyclic
depsipeptide with antibacterial and antiviral properties. Tetrahedron Letters, 1989. 30(5): p.
519-522.

22. Stawikowski, M. and P. Cudic, A novel strategy for the solid-phase synthesis of cyclic
lipodepsipeptides. Tetrahedron Letters, 2006. 47(48): p. 8587-8590.
23. Davies, J.S., The cyclization of peptides and depsipeptides. Journal of Peptide Science, 2003.
9(8): p. 471-501.
24. Socha, A.M., et al., Diversity-oriented synthesis of cyclic acyldepsipeptides leads to the
discovery of a potent antibacterial agent. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010. 18(20): p.
7193-7202.
25. Alexander, Antiinfective Lipopeptides 2008.
26. Lopez-Macia, A., et al., Synthesis and structure determination of kahalalide F. Journal of the
American Chemical Society, 2001. 123(46): p. 11398-11401.
27. Kuisle, O., E. Quinoa, and R. Riguera, A general methodology for automated solid-phase
synthesis of depsides and depsipeptides. Preparation of a valinomycin analogue. Journal of
Organic Chemistry, 1999. 64(22): p. 8063-8075.
28. Sarabia, F., C. Samy, and C. Garcia-Ruiz, Solid Phase Synthesis of Globomycin and SF-1902
A5 J. Org. Chem, 2011.
29. Romanovskis, P. and A.F. Spatola, Preparation of head-to-tail cyclic peptides via side-chain
attachment: Implications for library synthesis. Journal of Peptide Research, 1998. 52(5): p.
356-374.
30. Derbal, S., et al., On resin amino acid side chain attachment strategy for the head to tail
synthesis of new glutamine containing gramicidin-S analogs and their antimicrobial activity.
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2010. 20(19): p. 5701-5704.
31. Monroc, S., et al., Improvement of cyclic decapeptides against plant pathogenic bacteria
using a combinatorial chemistry approach. Peptides, 2006. 27(11): p. 2575-2584.
32. Seo, H. and D. Lim, Total Synthesis of Halicylindramide A. Journal of Organic Chemistry,
2009. 74(2): p. 906-909.
33. Hamze, A., J. Martinez, and J.F. Hernandez, Solid-phase synthesis of arginine-containing
peptides and fluorogenic substrates using a side-chain anchoring approach. Journal of
Organic Chemistry, 2004. 69(24): p. 8394-8402.
34. Kochi, M., Bact. Proc. , 1951: p. 29-30
35. Mouls, L., et al., O-N-Acyl migration in N-terminal serine-containing peptides: mass
spectrometric elucidation and subsequent development of site-directed acylation protocols.
Tetrahedron Letters, 2004. 45(6): p. 1173-1178.
36. Mauger, A.B. and O.A. Stuart, Slow O,N-acyl shift in an actinomycin-related peptide lactone.
International Journal of Peptide and Protein Research, 1987. 30(4): p. 481-488.
37. Burke, T.R. and B. Chandrasekhar, Preparative reversed-phase high-performance liquidchromatography
in the synthesis of viscosin, a cyclic depsipeptide. Journal of
Chromatography, 1989. 484: p. 293-298.
38. Guibe, F., Allylic protecting groups and their use in a complex environment - Part II: Allylic
protecting groups and their removal through catalytic palladium pi-allyl methodology.
Tetrahedron, 1998. 54(13): p. 2967-3042.
39. Verzele, D., Development of Miniature b(-HLH-)ZIP Peptidosteroid Conjugates as New
Transcription Factor Models. 2009, PhD thesis, universiteit Gent.
40. Merrifield, R.B., Solid phase peptide synthesis .1. Synthesis of a tetrapeptide. Journal of the
American Chemical Society, 1963. 85(14): p. 2149-&.
41. Merck Novabiochem, Peptide Synthesis. 2008/2009.
42. Lloyd-Williams, P., F. Albericio, and E. Giralt, Chemical approaches to the synthesis of
peptides and proteins. 1997, Barcelona, Spain.
43. rapp-polymer catalogue (http://www.rapp-polymere.com).
44. Isidro-Llobet, A., M. Alvarez, and F. Albericio, Amino Acid-Protecting Groups. Chemical
Reviews, 2009. 109(6): p. 2455-2504.
45. Kragol, G. and L. Otvos, Orthogonal solid-phase synthesis of tetramannosylated peptide
constructs carrying three independent branched epitopes. Tetrahedron, 2001. 57(6): p. 957-
966.
46. Karskela, T., et al., Solid-supported synthesis of bicyclic peptides containing three parallel
peptide chains. European Journal of Organic Chemistry, 2003(9): p. 1687-1691.

47. Chamorro, C., et al., A general approach for the non-stop solid phase synthesis of TACscaffolded
loops towards protein mimics containing discontinuous epitopes. Chemical
Communications, 2009(7): p. 821-823.
48. Dangles, O., et al., Selective cleavage of the allyl and allyloxycarbonyl groups through
palladium-catalyzed hydrostannolysis with tributyltin hydride - Application to the selective
protection-deprotection of amino-acid derivatives and in peptide-synthesis. Journal of Organic
Chemistry, 1987. 52(22): p. 4984-4993.
49. Benoiton, N.L. and F.M.F. Chen, 2-alkoxy-5(4H)-oxazolones from N-alkoxycarbonylamino
acids and their implication in carbodiimide-mediated reactions in peptide-synthesis. Canadian
Journal of Chemistry-Revue Canadienne De Chimie, 1981. 59(2): p. 384-389.
50. Benoiton, N.L., 2-alkoxy-5(4H)-oxazolones and the enantiomerization of Nalkoxycarbonylamino
acids. Biopolymers, 1996. 40(2): p. 245-254.
51. Albericio, F., et al., Use of onium salt-based coupling reagents in peptide synthesis. Journal of
Organic Chemistry, 1998. 63(26): p. 9678-9683.
52. Hancock, W.S. and J.E. Battersby, New micro-test for detection of incomplete coupling
reactions in solid-phase peptide-synthesis using 2,4,6-trinitrobenzene-sulphonic acid.
Analytical Biochemistry, 1976. 71(1): p. 260-264.
53. Madder, A., et al., A novel sensitive colorimetric assay for visual detection of solid-phase
bound amines. European Journal of Organic Chemistry, 1999(11): p. 2787-2791.
54. Caroen, J. and J. Van der Eycken, A sensitive and practical colorimetric test for polymersupported
hydroxyl and thiol groups. Tetrahedron Letters, 2009. 50(1): p. 41-44.
55. Shibata, N., et al., Electrophilic Sulfenylation in a Stereocontrolled Synthesis of Protected
(2F,3R)-3-Merccaptoaspartic Acid from L-Aspartic Acid. Tetrahedron Letters, 1996. 52(39):
p. 12839-12852.
56. Isidro-Llobet, A., et al., Fmoc-2-Mercaptobenzothiazole, for the Introduction of the Fmoc
Moiety Free of Side-Reactions. Biopolymers, 2007. 88.
57. Rew, Y. and M. Goodman, Solid-Phase Synthesis of Amine-bridged Cyclic Enkephalin
Analogues via On-Resin Cyclization Utilizing the Fukuyama-Mitsunobu Reaction. J. Org.
Chem, 2002. 67: p. 8820-8826.
58. Hu, A.F., et al., Benzyl 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl carbonate. Acta Crystallographica Section EStructure
Reports Online, 2008. 64: p. O1326-U2462.
59. Kisfaludy, L. and I. Schon, Preparation and applications of pentafluorophenyl esters of 9-
fluorenylmethyloxycarbonyl amino-acids for peptide-synthesis. Synthesis-Stuttgart, 1983(4):
p. 325-327.
60. Green, M. and J. Berman, Preparation of pentafluorophenyl esters of Fmoc protected aminoacids
with pentafluorophenyl trifluoroacetate. Tetrahedron Letters, 1990. 31(41): p. 5851-
5852.
61. Kunishima, M., et al., 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride:
An efficient condensing agent leading to the formation of amides and esters. Tetrahedron,
1999. 55(46): p. 13159-13170.
62. Kunishima, M., et al., Synthesis and characterization of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-
4-methylmorpholinium chloride. Tetrahedron Letters, 1999. 40(29): p. 5327-5330.
63. Kaminski, Z.J., et al., N-triazinylammonium tetrafluoroborates. A new generation of efficient
coupling reagents useful for peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society,
2005. 127(48): p. 16912-16920.
64. Gilon, C., Y. Klausner, and A. Hassner, Novel method for the facile synthesis of depsipeptides.
Tetrahedron Letters, 1979(40): p. 3811-3814.
65. Sieber, P. and B. Riniker, Protection of carboxamide functions by the trityl residue -
application to peptide-synthesis. Tetrahedron Letters, 1991. 32(6): p. 739-742.
66. Nielsen, J. and L.O. Lyngso, Combinatorial solid-phase synthesis of balanol analogues.
Tetrahedron Letters, 1996. 37(46): p. 8439-8442.
67. Yang, Y., et al., Aspartimide Formation in Base-driven 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Chemistry. Tetrahedron Letters, 1994. 35(52): p. 9689-9692

68. Burke, T.J., B. Chandrasekhar, and M. Knight, Analogs of Viscosin and their uses. 1992.
69. Lekkerkerker, H.N.W. and J.K.G. Dhont, On the calculation of the self-diffusion coefficient of
interacting Brownian particles. Journal of Chemical Physics, 1984. 80(11): p. 5790-5792.
70. Lide, D.R., "Handbook of Chemistry and Physics 90th edition". 2009-2010, CRC Press: Boca
Raton.