Optimization of the separation performance by using coupled columns packed with core-shell particles operated at 1200 bar

Jelle

De Vos

Hoe verbeterde analytische technieken uw gezondheid en leefomgeving kunnen beïnvloeden

Milieuvervuiling is een gevaar geworden voor de gezondheid van de mensheid. Wetgevende instanties zien hierop streng toe. De betrokken partijen zijn verplicht om vervuiling op te sporen aan de hand van analytische technieken. Één daarvan is vloeistofchromatografie, waarbij het monster in de vloeibare toestand wordt gescreend op zijn componenten. Hierbij wordt een toestel gebruikt dat het mengsel met onbekende stoffen doorheen een chromatografische kolom brengt, waarop de scheiding plaatsvindt. Uit onderzoek is gebleken dat twee nieuwe technologieën een significante verbetering geven van een chromatografische analyse. Enerzijds door het gebruiken van apparatuur dat een hogere systeemdruk levert en anderzijds door een nieuw deeltjestype in de analytische kolom. Deze technieken laten toe om chromatografische analyses sneller en beter te laten verlopen. Zo werd er een tijdswinst van 50% opgemeten voor scheidingen van kleine moleculen. Deze monsters werden door gebruik te maken van lange kolommen bij hoge drukken tot 20% beter gescheiden. Tenslotte is ook aangetoond dat, door het gebruik van deze methode, het bestuderen van biomarkers naar een hoger niveau kan worden getild.

Hoge-druk-vloeistofchromatografie (HPLC) is een veel gebruikte scheidingstechniek die toelaat om componenten in een mengsel van elkaar te scheiden. Hierbij wordt het monster geïnjecteerd in een kolom gevuld met deeltjes (de stationaire fase) waardoor een vloeistof (de mobiele fase) wordt gepompt. Er vindt een scheiding plaats als de componenten in het mengsel verschillende affiniteit hebben voor de stationaire fase. Het resultaat van een scheiding wordt door een detector geregistreerd als een chromatogram. Deze scheidingen worden meestal uitgevoerd door gebruik te maken van een 15 cm- kolom gevuld met 3 μm deeltjes. Helaas is de efficiëntie van een scheiding op deze opstelling te laag om een complex staal te analyseren. Sommige componenten zullen dus niet geïdentificeerd en gekwantificeerd kunnen worden.

Bij milieuanalyses worden bodem- en waterstalen genomen om vervolgens na te gaan of vervuiling van het oppervlaktewater is opgetreden. Typisch wordt er bij deze analyses gekeken naar kankerverwekkende stoffen zoals benzeenderivaten. Maar het is van belang dat zo’n analyses snel resultaten opleveren en dat, bovendien, geen analieten over het hoofd worden gezien. Het huidige onderzoek is dan ook gericht om betere scheidingen te realiseren in een korte analysetijd, door gebruik te maken van een nieuw type stationaire fase en ultra-hoge-druk-vloeistofchromatografie (UHPLC).

UHPLC laat toe om langere en efficiëntere chromatografische kolommen te gebruiken. Dit vereist wel dat de instrumentatie tegen hoge drukken boven 1000 bar bestand moet zijn. Anderzijds is er een nieuw type stationaire fase ontwikkelend bestaande uit een poreuze laag rondom een vaste kern met een totale diameter van 2.6 µm; wat zorgt voor scheidingen met hogere efficiëntie. In dit onderzoek werden voorgaande technologieën gecombineerd voor scheidingen van kleine moleculen en peptides. Het doel van deze studie was het nagaan van de efficiëntie van de scheidingen met deze nieuwe methodologie, voor een breed gamma aan analieten met relevantie in verschillende takken van de industrie. Het scheiden van complexere mengsels van kleine moleculen, voornamelijk vervuilende stoffen in afvalwater en parabenen, dienden als model voor scheidingen in milieu analyses en farmaceutische sector ( studie van onzuiverheden in API). Scheidingen van mengsels die verschillende peptides bevatten zijn van belang in studies van biomarkers. Het bestuderen van biomarkers is van belang voor het onderzoeken van ziektebeelden en het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen.

In het eerste onderdeel van het onderzoek werden de winst in analysetijd en chromatografische efficiëntie nagegaan voor scheidingen van moleculen met een laag moleculair gewicht. Daarbij werd gekeken naar de invloed van het verdubbelen van de druk over de chromatografische kolom, van 600 naar 1200, bar op efficiëntie en analysetijd. Bij deze experimenten werd piekcapaciteit gebruikt om de efficiëntie van een scheiding uit te drukken. Als een chromatogram een hogere piekcapaciteit heeft, dan zullen de componenten van het mengsel beter gescheiden zijn van elkaar.

De nieuwe generatie deeltjes in de chromatografische kolom leidt tot een kwantumsprong in de de efficiëntie van scheidingen in vergelijking met andere deeltjestypes. Door combinatie met UHPLC werden in de huidige studie de grenzen van de piekcapaciteit en analysetijd verlegd. De performantielimieten werden grafisch weergegeven met behulp van kinetische plots, waarin de experimentele analysetijd versus de opgemeten piekcapaciteit voor scheidingen van kleine moleculen werd uitgezet. Uit de analyse van deze kinetische plot is gebleken dat, door de kolomdruk te verdubbelen naar 1200 bar, er een tijdwinst is van 50% in analysetijd zonder de efficiëntie van de scheiding te beïnvloeden. Een winst in performantie (20%) zonder wijziging van analysetijd kon worden gerealiseerd door kolommen met elkaar te koppelen en te werken bij 1200 bar. Het koppelen van chromatografische kolommen was nodig om het kinetisch optimum (bij het optimale debiet over de kolom en maximale kolomdruk) te realiseren.

In het tweede deel van het onderzoek werden mengsels van peptides gebruikt om de verbeterde efficiëntie, door toepassen van de methodologie uit het eerste deel, aan te tonen voor proteomics onderzoek. Bij proteomics wordt het proteoom, dat alle eiwitten van een cel omvat, onderzocht met vloeistofchromatografie. Op een geoptimaliseerde 90 cm- kolom werd een maximale piekcapaciteit van 1363 in een analysetijd van 480 minuten opgemeten. Het bijhorende chromatogram toonde aan dat alle componenten nagenoeg volledig gescheiden zijn van elkaar. Dit maakt het mogelijk om alle peptiden in het mengsel foutloos te gaan identificeren. Na zorgvuldig vergelijken met experimentele, gerapporteerde waarden is gebleken dat in deze studie een record piekcapaciteit is opgemeten.

Concluderend, de toename in performantie die kan worden gegenereerd bij het overschakelen van een volledig geoptimaliseerde werkingsmodus van 600 bar, tot een volledig geoptimaliseerde 1200 bar modus, is aanzienlijk. De analysetijd voor kleine moleculen kon gehalveerd worden met behoud van piekcapaciteit. Wanneer de analysetijd constant werd gehouden, zorgde dit tot een toename in piekcapaciteit. Dit biedt voordelen voor milieuanalyses waar in korte tijd veel testmengsels moeten worden geanalyseerd. Bovendien kan door gebruik te maken van deze methodologie, en het verlengen van de analysetijd, de piekcapaciteit nog verder worden verhoogd voor scheidingen van peptides. Het identificeren van peptides helpt bij het ontrafelen van het proteoom van de cel, terwijl kwalitatieve informatie kan leiden tot de ontdekking van potentiële biomarkers.

Bibliografie

ADDIN Mendeley Bibliography CSL_BIBLIOGRAPHY [1] Martin, A.J.P., Synge, R.L.M., A new form of chromatogram employing two liquid phases. Biochemical Journal 1941, 35, 1358-1368.

[2] van Deemter, J., Zuiderweg, F., Klinkenberg, A., Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography. Chemical Engineering Science 1956, 5, 271-289.

[3] MacNair, J.E., Patel, K.D., Jorgenson, J.W., Ultrahigh-pressure reversed-phase capillary liquid chromatography: isocratic and gradient elution using columns packed with 1.0-micron particles. Analytical chemistry 1999, 71, 700-708.

[4] Giddings, J.C., Unified Separation Science, Wiley-Interscience, New York 1991.

[5] Snyder, L.R. and K., Introduction to modern liquid chromatography second edition, n.d.

[6] Cabooter, D., Fanigliulo, a, Bellazzi, G., Allieri, B., et al., Relationship between the particle size distribution of commercial fully porous and superficially porous high-performance liquid chromatography column packings and their chromatographic performance. Journal of chromatography. A 2010, 1217, 7074-81.

[7] Bristow, P., Standardization of test conditions for high performance liquid chromatography columns. Chromatographia 1977, 10, 279-289.

[8] Desmet, G., Clicq, D., Gzil, P., Geometry-independent plate height representation methods for the direct comparison of the kinetic performance of LC supports with a different size or morphology. Analytical chemistry 2005, 77, 4058-70.

[9] Neue, U.D., Peak capacity in unidimensional chromatography. Journal of chromatography. A 2008, 1184, 107-30.

[10] Broeckhoven, K., Cabooter, D., Lynen, F., Sandra, P., Desmet, G., The kinetic plot method applied to gradient chromatography: theoretical framework and experimental validation. Journal of chromatography. A 2010, 1217, 2787-95.

[11] Novotny, M., in:, Journal of Chromatography Library, 1984, pp. 194-259.

[12] Patel, K.D., Jerkovich, A.D., Link, J.C., Jorgenson, J.W., In-depth characterization of slurry packed capillary columns with 1.0-microm nonporous particles using reversed-phase isocratic ultrahigh-pressure liquid chromatography. Analytical chemistry 2004, 76, 5777-86.

[13] MacNair, J.E., Lewis, K.C., Jorgenson, J.W., Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical chemistry 1997, 69, 983-9.

[14] Jerkovich, A.D., Mellors, J.S., Jorgenson, J.W., Majors, R.E., in Ultrahigh Pressure. America 2003, 21.

[15] Desmet, G., Cabooter, D., Gzil, P., Verelst, H., et al., Future of high pressure liquid chromatography: do we need porosity or do we need pressure? Journal of chromatography. A 2006, 1130, 158-66.

[16] Horvath, C.G., Preiss, B.A., Lipsky, S.R., Fast liquid chromatography. Investigation of operating parameters and the separation of nucleotides on pellicular ion exchangers. Analytical Chemistry 1967, 39, 1422-1428.

[17] Kirkland, J.J., Techniques for High-Performance Liquid-Liquid and Ion Exchange Chromatography with Controlled Surface Porosity Column Packings . Journal of Chromatographic Science 1969, 7 , 361-365.

[18] Fekete, S., Fekete, J., Fast gradient screening of pharmaceuticals with 5 cm long, narrow bore reversed-phase columns packed with sub-3 μm core-shell and sub-2 μm totally porous particles. Talanta 2011, 84, 416-423.

[19] Fanigliulo, A., Cabooter, D., Bellazzi, G., Comparison of performance of high performance liquid chromatography columns packed with superficially and fully porous 2.5 μm particles using kinetic plots. Journal of 2010, 33, 3655-3665.

[20] Cabooter, D., Billen, J., Terryn, H., Lynen, F., et al., Detailed characterisation of the flow resistance of commercial sub-2 micrometer reversed-phase columns. Journal of chromatography. A 2008, 1178, 108-17.

[21] Fekete, S., Oláh, E., Fekete, J., Fast liquid chromatography: The domination of core-shell and very fine particles. Journal of chromatography. A 2011.

[22] Guillarme, D., Grata, E., Glauser, G., Wolfender, J.-L., et al., Some solutions to obtain very efficient separations in isocratic and gradient modes using small particles size and ultra-high pressure. Journal of chromatography. A 2009, 1216, 3232-43.

[23] Guillarme, D., Ruta, J., Rudaz, S., Veuthey, J.-L., New trends in fast and high-resolution liquid chromatography: a critical comparison of existing approaches. Analytical and bioanalytical chemistry 2010, 397, 1069-82.

[24] Fekete, S., Ganzler, K., Fekete, J., Efficiency of the new sub-2 μm core-shell (KinetexTM) column in practice, applied for small and large molecule separation. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 2011, 54, 482-90.

[25] Cabooter, D., Billen, J., Terryn, H., Lynen, F., et al., Kinetic plot and particle size distribution analysis to discuss the performance limits of sub-2 microm and supra-2 microm particle columns. Journal of chromatography. A 2008, 1204, 1-10.

[26] Guiochon, G., Gritti, F., Shell particles, trials, tribulations and triumphs. Journal of chromatography. A 2011, 1218, 1915-38.

[27] Liekens, A., Denayer, J., Experimental investigation of the difference in B-term dominated band broadening between fully porous and porous-shell particles for liquid chromatography using the. Journal of Chromatography A 2011, 1218, 4406-4416.

[28] Dolan, J.W., Snyder, L.R., Maintaining fixed band spacing when changing column dimensions in gradient elution. Journal of chromatography. A 1998, 799, 21-34.

[29] Vaast, A., Broeckhoven, K., Dolman, S., Comparison of the gradient kinetic performance of silica monolithic capillary columns with columns packed with 3 µm porous and 2.7 µm fused-core silica particles. Journal of Chromatography A 2012, 1228, 270-5.

[30] Neue, U.D., Kele, M., Performance of idealized column structures under high pressure. Journal of chromatography. A 2007, 1149, 236-44.

[31] Fallas, M.M., Neue, U.D., Hadley, M.R., McCalley, D.V., Investigation of the effect of pressure on retention of small molecules using reversed-phase ultra-high-pressure liquid chromatography. Journal of chromatography. A 2008, 1209, 195-205.

[32] Verstraeten, M., Broeckhoven, K., Lynen, F., Choikhet, K., et al., Comparison of the quantitative performance of constant pressure versus constant flow rate gradient elution separations using concentration-sensitive detectors. Journal of chromatography. A 2011, 1232, 65-76.

[33] Neue, U.D., Marchand, D.H., Snyder, L.R., Peak compression in reversed-phase gradient elution. Journal of chromatography. A 2006, 1111, 32-9.

[34] Carr, P.W., Stoll, D.R., Wang, X., Perspectives on Recent Advances in the Speed of High-Performance Liquid Chromatography. Analytical Chemistry 2011, 83, 1890-1900.

[35] Eeltink, S., Decrop, W.M.C., Steiner, F., Ursem, M., et al., Use of kinetic plots for the optimization of the separation time in ultra-high-pressure LC. Journal of separation science 2010, 33, 2629-35.

[36] Broeckhoven, K., Cabooter, D., Desmet, G., Maximizing Throughput with Optimized Column Lengths and Particle Diameters. LC-GC Europe 2011, 396.

[37] Zhang, Y., Wang, X., Mukherjee, P., Petersson, P., Critical comparison of performances of superficially porous particles and sub-2 microm particles under optimized ultra-high pressure conditions. Journal of chromatography. A 2009, 1216, 4597-605.

[38] Neue, U., Theory of peak capacity in gradient elution. Journal of Chromatography A 2005, 1079, 153-161.

[39] Wang, X., Stoll, D.R., Schellinger, A.P., Carr, P.W., Peak capacity optimization of peptide separations in reversed-phase gradient elution chromatography: fixed column format. Analytical chemistry 2006, 78, 3406-16.

[40] Petersson, P., Frank, A., Heaton, J., Euerby, M.R., Maximizing peak capacity and separation speed in liquid chromatography. Journal of separation science 2008, 31, 2346-57.

[41] Horie, K., Sato, Y., Kimura, T., Nakamura, T., et al., Estimation and optimization of the peak capacity of one-dimensional gradient high performance liquid chromatography using a long monolithic silica capillary column. Journal of chromatography. A 2012, 1228, 283-91.

[42] Shen, Y., Zhang, R., Moore, R.J., Kim, J., et al., Automated 20 kpsi RPLC-MS and MS/MS with chromatographic peak capacities of 1000-1500 and capabilities in proteomics and metabolomics. Analytical chemistry 2005, 77, 3090-100.

[43] Shen, Y., Zhao, R., Berger, S.J., Anderson, G. a, et al., High-efficiency nanoscale liquid chromatography coupled on-line with mass spectrometry using nanoelectrospray ionization for proteomics. Analytical chemistry 2002, 74, 4235-49.

[44] Kim, M.-sik, Choie, W.-suk, Shin, Y.S., Yu, M.-hee, Lee, S.-won, Development of Ultra-High Pressure Capillary Reverse-Phase Liquid Chromatography / Tandem Mass Spectrometry for High-Sensitive and High-Throughput Proteomics 2004, 25, 1833-1839.