Water Quality Assessment: Determining Dioxin Potency by Means of the CALUX Bioassay.

Ingrid

Keupers

Dioxines? Niet op mijn bord!

Wie herinnert zich de dioxinecrisis van 1999 niet? Tonnen kippen en zuivelproducten werden toen preventief vernietigd omdat dioxines in de voedselketen waren terechtgekomen. Maar weet je ook wat dioxines zijn en waarom iedereen er schrik van had? Dioxines zijn chemische verbindingen die extreem giftig zijn voor zowel dieren als mensen, zelfs bij zeer lage dosissen. Bovendien zijn het zeer stabiele verbindingen waardoor ze zich kunnen opstapelen in organismen.

Omdat dioxines niet van water houden concentreren ze zich in sedimenten in rivieren en in het slib in afvalwaterzuiveringsinstallaties. Zo vormen ze daar een soort van chemische tijdbom die kan afgaan wanneer de omstandigheden wijzigen. Bij gebruik van slib als meststof in de landbouw kunnen dioxines in de voedselketen geraken. Het is dan ook zeer belangrijk dat de hoeveelheid van dioxines die aanwezig is in sedimenten en in slib op een routinematige manier kan bepaald worden zodat op tijd kan ingegrepen worden.

Gas chromatografie in combinatie met hoge resolutie massa spectrometrie (GC-HRMS) is de standaard referentie methode om de hoeveelheid dioxines in een staal te bepalen. Deze analyse methode is echter zeer duur en tijdrovend en is dus niet geschikt om vele stalen op routinematige basis te analyseren. Om deze problemen te overkomen werd een bioassay ontwikkeld genaamd CALUX (Chemically Activated Luciferase Expression). Dit bioassay maakt gebruik van muizen kankercellen die genetisch gemodificeerd werden zodat ze licht produceren nadat ze in contact zijn gekomen met dioxines. De hoeveelheid licht die wordt geproduceerd is gerelateerd aan de hoeveelheid dioxines in het staal en zo kan een schatting gemaakt worden van de algehele dioxine toxicitiet. Deze biologische analyse methode is sneller en goedkoper dan het chemische alternatief en is daarom geschikter als screenings methode om vele stalen te analyseren.

Ondanks de voordelen van dit bioassay zijn er ook nog steeds enkele methodologische problemen die het routinegebruik ervan in de weg staan. Zo moet de opgemeten lichtproductie worden omgezet naar een schatting van de hoeveelheid dioxines in het staal. Hiervoor wordt de lichtproductie van een referentiestaal bij verschillende concentraties vergeleken met de lichtproductie van het staal, tevens bij verschillende concentraties. Om deze vergelijking te kunnen maken is echter een wiskundig model nodig dat een zo goed mogelijke fit geeft aan de experimenteel opgemeten data. Vaak wordt gebruik gemaakt van de Hill vergelijking om de s-vormige curve te beschrijven. Een andere methode bestaat erin om eerst een Box-Cox transformatie van de punten door te voeren zodat een rechte wordt bekomen in plaats van een s-vormige curve. Dit vergemakkelijkt de verdere berekeningen aangezien het veel makkelijker is om de rechte te vinden die de best mogelijke fit geeft dan om een s-vormige curve te vinden die het best past bij de data. Met mijn experimentele data heb ik kunnen aantonen dat beide berekeningsmethoden hetzelfde resultaat opleveren, maar dat de laatste methode het voordeel heeft dat minder punten moeten worden opgemeten en dat de precisie op het bekomen resultaat ook veel groter is. Om al deze berekingen te automatiseren werd ook een programma geschreven in de Visual Basic editor in Excel. Dit vergemakkelijkt de analyse en laat een zekere uniformisering van het resultaat toe. Er werd gekozen om het programma dynamisch te maken. Dit wil zeggen dat alle berekeningen kunnen worden aangepast aan een verschillende experimentele set-up die de onderzoeker zelf kan aangeven als input in het programma. Dit maakt het programma ook bruikbaar voor verder onderzoek naar dioxines.

Een ander probleem bij het gebruik van het CALUX bioassay is de mogelijkheid tot vergelijking van het bekomen resultaat met het resultaat zoals bekomen met de standaard referentie techniek nl. GC-HRMS. Om deze vergelijking correct te kunnen maken zou hetzelfde staal geanalyseerd moeten worden door beide technieken. Dit is momenteel echter niet het geval. Het probleem is dat het sedimentstaal niet rechtstreeks kan geïnjecteerd worden in de GC-HRMS noch kan het rechstreeks toegediend worden aan de CALUX cellen. Om de analyse van het staal mogelijk te maken dient eerst een extractie van de dioxines te gebeuren. Dit kan men niet zo specifiek doen dat enkel de dioxines worden onttrokken uit het staal en daarom is vervolgens een verwijdering van stoffen die mogelijk kunnen interferen met het resultaat nodig. Deze voorbereiding van het staal (extractie en opzuivering) is verschillend voor beide analyse methoden waardoor een correcte vergelijking tussen beide resultaten niet mogelijk is. Een eventueel verschil kan immers gewoon te wijten zijn aan verschillen in de voorbereiding van het staal. Daarom werd een nieuwe preparatiemethode opgesteld die zowel kan gebruikt worden voor het analyseren van stalen via GC-HRMS als CALUX. Hiervoor werd gebruikt gemaakt van een bestaande preparatiemethode voor CALUX waaraan een extra stap werd toegevoegd die de zwavel uit het staal haalt. De GC-HRMS analyse is immers zeer gevoelig voor zwavel, een stof die veelvuldig voorkomt in zuurstofarme sedimenten. Er werd gekozen om zwavel uit het staal te halen door een geactiveerde koper kolom te gebruiken. Het zwavel reageert met het koper en vormt een zwarte neerslag van kopersulfide. Deze extra opkuisstap beïnvloed de CALUX cellen niet aangezien hetzelfde resultaat werd bekomen als met de reeds bestaande preparatiemehtode voor CALUX. Door deze gewijzigde staalvoorbereiding te gebruiken kunnen de resultaten van zowel de standaardreferentie methode als de screeningmethode beter met elkaar vergeleken worden.

Tot slot kunnen we stellen dat de resultaten van dit thesisonderzoek bijdragen tot het betrouwbaarder maken van het CALUX bioassay resultaat, een methode die het routinematig analyseren van vele stalen op de aanwezigheid van alarmerende hoeveelheden dioxines mogelijk maakt.

Bibliografie

Ahlborg, U.; Becking, G.; Birnbaum, L.; Brouwer, A.; Derks, H.; Feeley, M.; Golor, G.; Hanberg, A.; Larsen, J.; Liem, A.; Safe, S.; Schlatter, C.; Waern, F.; Younes, M. & Yrjänheikki, E. (1994). Toxic equivalency factors for dioxin-like PCBs: Report on WHO-ECEH and IPCS consultation, December 1993. Chemosphere 28, pp. 1049-1067.

Basu, D., Mukerjee, D., Neal, M., Olson, J. & Hee, S. (1985). Health Assessment Document for Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency, 618 pp. [EPA-600/8-84/014F].

Bellar, T.A. & Lichtenberg, J.J. (1981). The Determination of Polychlorinated Biphenyls in Transformer Fluid and Waste Oils. Cincinnati, OH: U.S. Environmental Protection Agency, 20 pp. [EPA-600/4-81-045].

Birch, G., Harrington, C., Symons, R. & Hunt, J. (2007). The source and distribution of polychlorinated dibenzo-p-dioxin and polychlorinated dibenzofurans in sediments of Port Jackson, Australia. Marine Pollution Bulletin 54(3), pp. 295 - 308.

Birnbaum, L.S. & DeVito, M.J. (1995). Use of toxic equivalency factors for risk assessment for dioxins and related compounds. Toxicology 105(2-3), pp. 391-401.

Blumer, M. (1957). Removal of Elemental Sulfur from Hydrocarbon Fractions. Analytical Chemistry 29(7), pp. 1039-1041.

Bossi, R., Larsen, B. & Premazzi, G. (1992). Polychlorinated biphenyl congeners and other chlorinated hydrocarbons in bottom sediment cores of Lake Garda (Italy). The Science of The Total Environment 121, pp. 77 - 93.

Brooks, J.M., Kennicutt, M.C., Wade, T.L., Hart, A.D., Denoux, G.J. & McDonald, T.J. (1990). Hydrocarbon distributions around a shallow water multiwell platform. Environmental Science & Technology 24(7), pp. 1079-1085.

Brown, M.M., Schneider, U.A., Petrulis, J.R. & Bunce, N.J. (1994). Additive Binding of Polychlorinated Biphenyls and 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin to the Murine Hepatic Ah Receptor. Toxicology and Applied Pharmacology 129(2), pp. 243-251.

Brown, D.J., Orelien, J., Gordon, J.D., Chu, A.C., Chu, M.D., Nakamura, M., Handa, H., Kayama, F., Denison, M.S. & Clark, G.C. (2007). Mathematical Model Developed for Environmental Samples: Prediction of GC/MS Dioxin TEQ from XDS-CALUX Bioassay Data. Environmental Science & Technology 41, pp. 4354-4360.

Canadian Council of Ministers of the Environment (2001). Canadian sediment quality guidelines for the protection of aquatic life: Polychlorinated dioxins and furans (PCDD/Fs). In: Canadian Council of Ministers of the Environment (1999): Canadian environmental quality guidelines. Winnipeg.

Carbonnelle, S., Loco, J.V., Overmeire, I.V., Windal, I., Wouwe, N.V., Leeuwen, S.V. & Goeyens, L. (2004). Importance of REP values when comparing the CALUX bioassay results with chemoanalyses results: Example with spiked vegetable oils. Talanta 63(5), pp. 1255-1259.

Currie, L.A. (1995). Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities (IUPAC Recommendations 1995). Pure and Applied Chemistry 67(10), pp. 1699-1724.

Davis, J.A. (2004). The long-term fate of polychlorinated biphenyls in San Francisco Bay (USA). Environmental Toxicology and Chemistry 23, pp. 2396-2409.

Denison, M.S. & Nagy, S.R. (2003). Activation of the aryl hydrocarbon receptor by structurally diverse exogenous and endogenous chemicals. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, Annual Reviews 43, pp. 309-334.

Denison, M.S., Seidel, S.D., Ziccaedi, M., Rogers, W.J., Brown, D. & Clark, G. (1999). Ah receptor-based bioassays for dioxins and related chemicals: Applications and limitations. Organohalogen compounds 40, pp. 27-30.

Denison, M.S., Zhao, B., Baston, D.S., Clark, G.C., Murata, H. & Han, D. (2004). Recombinant cell bioassay systems for the detection and relative quantitation of halogenated dioxins and related chemicals. Talanta 63(5), pp. 1123-1133.

DeVito, M. & Birnbaum, L.S. (1994). Toxicology of dioxins and related chemicals. In: Schecter, A. (ed.). Dioxins and Health. New York: Elsevier. pp. 139-162.

Di Giulio, R.T., Benson, W.H., Sanders, B.M. & van Veld, P.A. (1995). Biochemical mechanisms: metabolism, adaptation and toxicity In: Rand, G. M. (ed.). Fundamentals of aquatic toxicology. Washington, DC: Taylor and Francis, pp. 523-561.

DiVincenzo, J.P. & Sparks, D.L. (1997). Slow Sorption Kinetics of Pentachlorophenol on Soil: Concentration Effects. Environmental Science & Technology 31(4), pp. 977-983.

Ellison, S.L.R., Rosslein, M. & Williams, A. (2000). Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/CITAC, 126 pp. [CITAC Guide number 4].

Elskens, M., de Brauwere, A., Beucher, C., Corvaisier, R., Savoye, N., Tréguer, P. & Baeyens, W. (2007). Statistical process control in assessing production and dissolution rates of biogenic silica in marine environments. Marine Chemistry 106, pp. 272-286.

Elskens, M., Baston, D.S., Stumpf, C., Haedrich, J., Denison, M.S., Baeyens, W. & Goeyens, L. (2010). CALUX measurements: statistical inferences for the dose response curve. In press.

Esposito, M.P., Tiernan, T.O. & Dryden, F.E. (1980). Dioxins. Cincinatti, OH: U.S. Environmental Protection Agency, 369 pp. [EPA-600/2-80-197].

Fattore, E., Trossvik, C. & Hakansson, H. (2000). Relative potency values derived from hepatic vitamin A reduction in male and female Sprague-Dawley rats following subchronic dietary exposure to individual polychlorinated dibenzo-p-dioxin and dibenzofuran congeners and a mixture thereof. Toxicology and Applied Pharmacology 165, pp. 184-194.

Fernandez-Salguero, P.M., Hilbert, D.M., Rudikoff, S., Ward, J.M. & Gonzalez, F.J. (1996). Aryl-hydrocarbon receptor-deficient mice are resistant to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced toxicity. Toxicology and Applied Pharmacology 140, pp. 173-179.

Gao, X., Son, D.S., Terranova, P.F. & Rozman, K.K. (1999). Toxic equivalency factors of polychlorinated dibenzo-p-dioxins in an ovulation model: validation of the toxic equivalency concept for one aspect of endocrine disruption. Toxicology and Applied Pharmacology 157, pp. 107-116.

Garrison, P.M., Tullis, K., Aarts, J.M.M.J.G., Brouwer, A., Giesy, J.P. & Denison, M.S. (1996). Species-Specific Recombinant Cell Lines as Bioassay Systems for the Detection of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin-like Chemicals. Fundamental and Applied Toxicology 30(2), pp. 194-203.

Goerlitz, D.F. & Law, L.M. (1971). Note on Removal of Sulfur Interferences from Sediment Extracts for Pesticide Analysis. Bulletin of Environmental Contamination & Toxicology 6(1), pp. 9-10.

Guthrie, E.A. & Pfaender, F.K. (1998). Reduced Pyrene Bioavailability in Microbially Active Soils. Environmental Science & Technology 32, pp. 501-508.

Hamm, J.T., Chen, C.Y. & Birnbaum, L.S. (2003). A mixture of dioxins, furans, and non-ortho PCBs based upon consensus toxic equivalency factors produces dioxin-like reproductive effects. Toxicological Sciences 74, pp. 182-191.

Han, D., Nagy, S.R. & Denison, M.S. (2004). Comparison of recombinant cell bioassays for the detection of Ah receptor agonists. Biofactors 20(1), pp. 11-22.

Hatzinger, P.B. & Alexander, M. (1995). Effect of Aging of Chemicals in Soil on Their Biodegradability and Extractability. Environmental Science & Technology 29(2), pp. 537-545.

Hawker, D.W. & Connell, D.W. (1988). Octanol-water partition coefficients of polychlorinated biphenyl congeners. Environmental Science & Technology 22(4), pp. 382-387.

Health Council of the Netherlands (1996). Polychlorinated dibenzo-p-dioxins, dibenzofurans and dioxin-like polychlorinated biphenyls. Rijswijk: Health Council of the Netherlands. Committee on Risk Evaluation of Substances/Dioxins. [Publication no. 1996/10].

Hertzberg, R.C. & MacDonell, M.M. (2002). Synergy and other ineffective mixture risk definitions. The Science of The Total Environment 288(1-2), pp. 31 - 42.

Hestermann, E.V., Stegeman, J.J. & Hahn, M.E. (2000). Relative Contributions of Affinity and Intrinsic Efficacy to Aryl Hydrocarbon Receptor Ligand Potency. Toxicology and Applied Pharmacology 168(2), pp. 160 - 172.

Japan EPA (2002). Environmental standard of PCDD/F concentrations proposed in atmosphere, water, sediment and soil. [Available online at http://www.env.go.jp/kijun/dioxin.html].

Jin, M., Xia, Y., Lei, T., Ma, S., Qiu, J. & Zhang, R. (2007). Note on sulfur removal with metallic copper. Geochemistry International 45(6), pp. 620-623.

Johansson, N., Waern, F., Trossvik, C., Manzoor, E., Ahlborg, U.G. & Hakansson, H. (1995). Toxicological interactions between 2,3,7,8-TCDD, 1,2,3,7,8-PeCDD and 2,3,4,7,8-PeCDF in rat. Organohalogen compounds 25, pp. 7-10.

Jones, J.M. & Anderson, J.W. (1999). Relative potencies of PAHs and PCBs based on the response of human cells. Environmental Toxicology and Pharmacology 7(1), pp. 19-26.

Ko, C., Song, H.-I., Park, J.-H., Han, S.-S. & Kim, J.-N. (2007). Selective removal of sulfur compounds in city-gas by adsorbents. Korean Journal of Chemical Engineering 24(6), pp. 1124-1127.

Kodavanti, P.R.S., Ward, T.R., McKinney, J.D. & Tilson, H.A. (1996). Inhibition of microsomal and mitochondrial Ca2+-sequestration in rat cerebellum by polychlorinated biphenyl mixtures and congeners. Archives of Toxicology 70(3-4), pp. 150-157.

MacDonald, D.D., Ingersoll, C.G. & Berger, T.A. (2000). Development and Evaluation of Consensus-Based Sediment Quality Guidelines for Freshwater Ecosystems. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 39(1), pp. 20-31.

Mader, B.T., Uwe-Goss, K. & Eisenreich, S.J. (1997). Sorption of Nonionic, Hydrophobic Organic Chemicals to Mineral Surfaces. Environmental Science & Technology 31(4), pp. 1079-1086.

Mason, G., Farrell, K., Keys, B., Piskorska-Pliszczynska, J., Safe, L. & Safe, S. (1986). Polychlorinated dibenzo-p-dioxins: Quantitative in vitro and in vivo structure-activity relationships. Toxicology 41(1), pp. 21 - 31.

Masunaga, S., Yao, Y., Ogura, I., Nakai, S., Kanai, Y., Yamamuro, M. & Nakanishi, J. (2001). Identifying Sources and Mass Balance of Dioxin Pollution in Lake Shinji Basin, Japan. Environmental Science & Technology 35(10), pp. 1967-1973.

Miller, J.N. & Miller, J.C. (2005). Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. New Jersey: Pearson Prentice Hall, 268 pp.

Nam, K. & Alexander, M. (1998). Role of Nanoporosity and Hydrophobicity in Sequestration and Bioavailability: Tests with Model Solids. Environmental Science & Technology 32(1), pp. 71-74.

NATO/CCMS (1988). Scientific basis for the development of the International Toxicity Equivalency Factor (I-TEF) method of risk assessment for complex mixtures of dioxins and related compounds. 64 pp. [EPA-600/6-90/015].

Nording, M., Denison, M.S., Baston, D., Persson, Y., Spinnel, E. & Haglund, P. (2007). Analysis of dioxins in contaminated soils with the CALUX and CAFLUX bioassays, an immunoassay, and gas chromatography/high-resolution mass spectrometry. Environmental Toxicology and Chemistry 26(6), pp. 1122–1129.

Oris, J.T. & Bailer, A.J. (1997). Equivalence of Concentration-Response Relationships in Aquatic Toxicology Studies: Testing and Implications for Potency Estimation. Environmental Toxicology and Chemistry 16(10), pp. 2204-2209.

Piatt, J.J. & Brusseau, M.L. (1998). Rate-Limited Sorption of Hydrophobic Organic Compounds by Soils with Well-Characterized Organic Matter. Environmental Science & Technology 32(11), pp. 1604-1608.

Pignatello, J.J. & Xing, B. (1996). Mechanisms of Slow Sorption of Organic Chemicals to Natural Particles. Environmental Science & Technology 30(1), pp. 1-11.

Poland, A., Glover, E. & Kende, A.S. (1976). Stereospecific, high affinity binding of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin by hepatic cytosol. Evidence that the binding species is receptor for induction of aryl hydrocarbon hydroxylase. Journal of Biological Chemistry 251(16), pp. 4936-4946.

Putzrath, R.M. (1997). Estimating Relative Potency for Receptor-Mediated Toxicity: Reevaluating the Toxicity Equivalence Factor (TEF) Model. Regulatory Toxicology and Pharmacology 25(1), pp. 68-78.

Ramesh, A., Walker, S.A., Hood, D.B., Guillén, M.D., Schneider, K. & Weyand, E.H. (2004). Bioavailability and Risk Assessment of Orally Ingested Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. International Journal of Toxicology 23(5), pp. 301-333.

Rappe, C. (1996). Sources and environmental concentrations of dioxins and related compounds. Pure and Applied Chemistry 68(9), pp. 1781-1789.

Reid, B.J., Jones, K.C. & Semple, K.T. (2000). Bioavailability of persistent organic pollutants in soils and sediments. A perspective on mechanisms, consequences and assessment. Environmental Pollution 108(1), pp. 103-112.

Safe, S.H. (1988). The aryl hydrocarbon receptor. ISI Atlas of Science: Pharmacology 2, pp. 8-83.

Safe, S.H. (1990). Polychlorinated Biphenyls (PCBs), Dibenzo-p-Dioxins (PCDDs), Dibenzofurans (PCDFs), and Related Compounds: Environmental and Mechanistic Considerations which support the Development of Toxic Equivalency Factors (TEFs). Critical Reviews in Toxicology 21(1), pp. 51-88.

Safe, S.H. (1993). Development of Bioassays and Approaches for the Risk Assessment of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and Related-compounds. Environmental Health Perspectives 101, pp. 317-325.

Safe, S.H. (1997). Limitations of the toxic equivalency factor approach for risk assessment of TCDD and related compounds. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis 17(4-5), pp. 285-304.

Sanctorum, H. (2009). Substances with dioxin-like activity in the aquatic environment assessed by the CALUX bioassay. Faculteit Wetenschappen Vrije Universiteit Brussel: Laboratorium voor Analytische Milieuchemie, 204 pp.

Sand, S., Victorin, K. & Filipsson, A.F. (2008). The current state of knowledge on the use of the benchmark dose concept in risk assessment. Journal of Applied Toxicology 28(4), pp. 405-421.

Schroijen, C., Windal, I., Goeyens, L. & Baeyens, W. (2004). Study of the interference problems of dioxin-like chemicals with the bio-analytical method CALUX. Talanta 63(5), pp. 1261-1268.

Schubert, P., Fernández-Escobar, I., Rosenberg, E. & Bayona, J.-M. (1998). Evaluation of desulfurization procedures for the elimination of sulfur interferences in the organotin analysis of sediments. Journal of Chromatography A 810(1-2), pp. 245 - 251.

Stockholm convention on persistent organic pollutants (2001). 43 pp. [Available online at http://www.pops.int].

Tan, Y.L., Kong, A. & Chiu, Y.-O. (1993). Sample Preparation for Analyzing Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Polychlorinated Dibenzo-p-Dioxins and Dibenzofurans in Sediment by Gas Chromatography/Mass Spectrometry. Estuaries 16(3A), pp. 427-432.

Thomann, R.V. & Komlos, J. (1999). Model of biota-sediment accumulation factor for polycyclic aromatic hydrocarbons. Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 1060-1068.

Tong, P. & Imagawa, T. (1995). Optimization of supercritical fluid extraction for polychlorinated biphenyls from sediments. Analytica Chimica Acta 310(1), pp. 93 - 100.

Tremblay, L., Kohl, S.D., Rice, J.A. & Gagné, J.-P. (2005). Effects of temperature, salinity, and dissolved humic substances on the sorption of polycyclic aromatic hydrocarbons to estuarine particles. Marine Chemistry 96(1-2), pp. 21-34.

U. S. EPA (1996). Method 3660B. Sulfur Cleanup. 6 pp.

U.S. EPA (2005). Innovative Technology Verification Report. Technologies for Monitoring and Measurement of Dioxin and Dioxin-like Compounds in Soil and Sediment. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency, 109 pp. [EPA-540/R-05/001].

U.S. EPA (2006). An Inventory of Sources and Environmental Releases of Dioxin-Like Compounds in the U.S. for the Years 1987, 1995, and 2000. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency, 677 pp. [EPA-600/P-03/002F].

U.S. EPA (2008). Method 4435. Method for TEQs determinations for dioxin-like chemical activity with the CALUX bioassay. 58 pp.

Van den Berg, M., Birnbaum, L., Bosveld, A., Brunström, B., Cook, P., Feeley, M., Giesy, J.P., Hanberg, A., Hasegawa, R., W., K.S., Kubiak, T., Larsen, J., van Leeuwen, F., Liem, A.K., Nolt, C., Peterson, R., Poellinger, L., Safe, S., Schrenk, D., Tillitt, D., Tysklind, M., Younes, M., Waern, F. & Zacharewski, T. (1998). Toxic equivalency factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for humans and wildlife. Environmental Health Perspectives 106(12), pp. 775-792.

Van den Berg, M., Birnbaum, L.S., Denison, M., De Vito, M., Farland, W., Feeley, M., Fiedler, H., Hakansson, H., Hanberg, A., Haws, L., Rose, M., Safe, S., Schrenk, D., Tohyama, C., Tritscher, A., Tuomisto, J., Tysklind, M., Walker, N. & Peterson, R.E. (2006). The 2005 World Health Organization Reevaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-Like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), pp. 223-241.

Van Overmeire, I., Loco, J.V., Roos, P., Carbonnelle, S. & Goeyens, L. (2004). Interpretation of CALUX results in view of the EU maximal TEQ level in milk. Talanta 63(5), pp. 1241-1247.

Van Wouwe, N., Windal, I., Vanderperren, H., Eppe, G., Xhrouet, C., Massart, A.-C., Debacker, N., Sasse, A., Baeyens, W., Pauw, E.D., Sartor, F., Oyen, H.V. & Goeyens, L. (2004). Validation of the CALUX bioassay for PCDD/F analyses in human blood plasma and comparison with GC-HRMS. Talanta 63(5), pp. 1157-1167.

Villeneuve, D.L., Blankenship, A.L. & Giesy, J.P. (2000). Derivation and application of relative potency estimates based on in vitro bioassay results. Environmental toxicology and chemistry 19(11), pp. 2835-2843.

Walker, N.J., Crockett, P.W., Nyska, A., Brix, A.E., Jokinen, M.P., Sells, D.M., Hailey, J.R., Easterling, M., Haseman, J.K., Yin, M., Wyde, M.E., Bucher, J.R. & Portier, C.J. (2005). Dose-additive carcinogenicity of a defined mixture of "dioxin-like compounds". Environmental Health Perspectives 113, pp. 43-48.

Wang, D., Jiang, G. & Cai, Z. (2007). Method development for the analysis of polybrominated dibenzo-p-dioxins, dibenzofurans and diphenyl ethers in sediment samples. Talanta 72(2), pp. 668 - 674.

Wang, B.Y., Gang Zhang, T.H., Jun Wang, T.N., Masafumi Handa, H.H. & Chunching Murata, H. (2009). CALUX Bioassay of Dioxin-Like Compounds in Sediments from the Haihe River, China. Soil and Sediment Contamination 18(4), pp. 397-411.

Welch, B.L. (1947). The generalization of "Student's" problem when several different population variances are involved. Biometrika 34(1–2), pp. 28-35.

WHO (1998). Assessment of the health risk of dioxins: re-evaluation of the Tolerable Daily Intake (TDI). Executive summary of the WHO Consultation, May 25-29 1998, Geneva, Switzerland.

Whyte, J.J., Schmitt, C.J. & Tillitt, D.E. (2004). The H4IIE cell bioassay as an indicator of dioxin-like chemicals in wildlife and the environment. Critical Reviews In Toxicology 34(1), pp. 1-83.

Windal, I., Denison, M.S., Birnbaum, L.S., Van Wouwe, N., Baeyens, W. & Goeyens, L. (2005). Chemically Activated Luciferase Gene Expression (CALUX) Cell Bioassay Analysis for the Estimation of Dioxin-Like Activity: Critical Parameters of the CALUX Procedure that Impact Assay Results. Environmental Science & Technology 39(19), pp. 7357-7364.

Wise, S.A. & Watters, R.L. (2008). Certificate of Analysis. Standard Reference Material® 1944. New York/New Jersey Waterway Sediment. Gaithersburg, MD: National Institute of Standards & Technology.

Wu, R.S., Chan, A.K., Richardson, B.J., Au, D.W., Fang, J.K., Lam, P.K. & Giesy, J.P. (2008). Measuring and monitoring persistent organic pollutants in the context of risk assessment. Marine Pollution Bulletin 57(6), pp. 236-244.

Yang, K., Zhu, L., Lou, B. & Chen, B. (2005). Correlations of nonlinear sorption of organic solutes with soil/sediment physicochemical properties. Chemosphere 61(1), pp. 116-128.

You, J. & Lydy, M.J. (2004). Evaluation of Desulfuration Methods for Pyrethroid, Organophosphate, and Organochlorine Pesticides in Sediment with High Sulfur Content. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 47(2), pp. 148-153.