Constructie en karakterisatie van rfaG mutant in Lactobacillus rhamnosus GG (LGG)

Hanne
Tytgat

 

Bacteriën die je gezond maken, utopie of realiteit?

 

Wereldwijd stijgt het aantal patiënten met ernstige darmaandoeningen, zoals de ziekte van Crohn. Merkwaardig is dat zware darmontstekingen veel vaker voorkomen in de ontwikkelde landen en minder in minder ontwikkelde regio’s. Volgens wetenschappers heeft dat te maken met de hygiëne in de verschillende delen van de wereld. In welvarende landen zorgt die ervoor dat mensen nauwelijks nog in contact komen met micro-organismen. Een verlaagde blootstelling aan bacteriën, belangrijke ziekteverwekkers, lijkt een goede zaak. Het kan echter ook het vaker voorkomen van darmaandoeningen verklaren in deze regio’s.

 

De mens leeft in nauw contact met duizenden micro-organismen, waarvan de meeste zich in ons spijsverteringsstelsel situeren: de darmflora. De darmflora van gezonde personen bestaat uit een verzameling van verschillende soorten bacteriën, die er samen voor zorgen dat we in staat zijn ons voedsel te verteren en ons lichaam beschermen tegen infecties door slechte bacteriën. Bij de geboorte is er nog geen sprake van een darmflora. Deze ontstaat gedurende de eerste dagen van ons leven. Tijdens de eerste levensjaren groeit deze uit tot een evenwichtige verzameling van bacteriën, waarin de verschillende micro-organismen samenwerken om hun belangrijke taken uit te voeren. Bacteriën kunnen de mens dus niet alleen ziek maken, maar zijn ook essentieel om gezond te leven.

Maar hier knelt het schoentje: door de toenemende hygiëne komen de mensen veel minder in contact met micro-organismen, en dus ook niet met deze gezonde soorten bacteriën. Dit heeft nefaste gevolgen voor de samenstelling van de darmflora en vaak ontstaat een onevenwicht tussen de verschillende stammen. De voedingsindustrie speelt hier op in door producten op de markt te brengen waaraan deze gunstige bacteriën zijn toegevoegd. Denk maar aan Actimel. Deze functionele voedingsmiddelen kunnen de darmflora beter in balans brengen en zelfs bescherming bieden tegen bepaalde aandoeningen.

De bacteriën die toegediend worden, heten probiotica. Dit zijn  ‘levende micro-organismen, die, indien ze in voldoende hoeveelheden worden opgenomen, een positief gezondheidseffect hebben op de gastheer’. In de toekomst zouden probiotica kunnen ingezet worden bij de behandeling van een hele rits immuunziekten, allergieën en darmaandoeningen, door de natuurlijke balans van de darmflora te herstellen.

 

Hoewel probiotica op dit moment al worden toegevoegd aan voedingsmiddelen – met duidelijk gunstige effecten - is de wetenschappelijke kennis over hun werkingsmechanismen beperkt. Vandaar dat wereldwijd gezocht wordt naar wat probiotica nu net zo probiotisch maken.

Daarbij wordt vooral gekeken naar de moleculen die voorkomen op het oppervlak van deze bacteriën en de moleculen die deze bacteriën uitscheiden in hun omgeving. Deze twee soorten zijn namelijk ideale kandidaten om te interageren met de darmwand van hun gastheer, de mens.

Ook aan de K.U.Leuven wordt meegewerkt aan dit onderzoek. In het Centrum voor Microbiële en Plantengenetica (CMPG) wordt de probiotische bacterie Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) onderzocht. LGG is wereldwijd uitgegroeid tot een modelorganisme voor de probiotica en maakt deel uit van de gezonde darmflora. Dit impliceert dat deze bacterie volledig veilig is om mee te werken en kan overleven in de verschillende moeilijke condities in het spijsverteringsstelsel (maagzuur, gal…).

Om de rol van verschillende oppervlaktemoleculen bij de werking van probiotica te onderzoeken, worden stammen aangemaakt die zodanig gemanipuleerd zijn dat deze een oppervlaktemolecule missen: mutanten. Door deze mutanten te vergelijken met gewone LGG bacteriën, kan nagegaan worden wat het effect is van het verwijderde oppervlaktemolecule. Op die manier kon de afgelopen jaren al heel wat kennis vergaard worden over de werking van probiotica, maar de weg naar een volledig begrip van de mechanismen die hier spelen is nog lang. De gunstige werking is namelijk het resultaat van een complex netwerk van interacties en moleculen. Gestaag worden de verschillende componenten en stappen van dit netwerk verder ontrafeld.

 

Om nieuwe inzichten te verwerven in de werking van probiotica, en in ons geval LGG, werd zo’n nieuwe mutant aangemaakt. Er werd gekozen om een enzym uit te schakelen dat verantwoordelijk is voor de aanhechting van suikerstructuren op oppervlaktemoleculen: het glycosyltransferase RfaG. Door dit enzym te elimineren, worden deze suikers niet meer correct aangebracht en is de structuur van dit molecule niet meer functioneel. Suikers komen in heel diverse en unieke structuren voor op het celwandoppervlak van bacteriën en zijn dan ook ideale kandidaten om een rol te spelen bij interacties tussen de probiotische bacteriën en hun gastheer.

Door deze nieuwe mutant, de rfaG mutant, te vergelijken met niet-gemanipuleerd LGG, kunnen inzichten verworven worden over het molecule dat door het uitgeschakelde enzym wordt voorzien van suikers. Ook kan nagegaan worden wat de rol van deze suikerstructuren is bij de probiotische werking van LGG. Dit alles kan ons helpen om meer te weten te komen over het complexe netwerk dat de werking van probiotica stuurt. Het aanmaken van zo’n mutant is echter geen sinecure. De afgelopen jaren werden daarom in het CMPG verschillende speciale methoden gecreëerd die wetenschappers in staat te stellen om LGG te onderzoeken.

Eerste resultaten hebben al belangrijke aanwijzingen opgeleverd, maar verder onderzoek is nodig om het precieze molecule te identificeren dat door het uitgeschakelde enzym wordt voorzien van suikers. Mogelijk is dit enzym betrokken bij de aanhechting van suikers op pili, proteïnerijke uitstulpingen op het oppervlak van LGG. Andere resultaten wijzen op een mogelijke rol bij de synthese van glucoserijke suikerstructuren op het oppervlak van LGG. Doorgedreven verder onderzoek van deze mutant zal moeten uitwijzen welke hypothese correct is.

 

Het onderzoek van één component van de celwand van LGG heeft dus op zich al heel wat voeten in de aarde en neemt veel tijd in beslag. De afgelopen jaren konden heel wat doorbraken gerealiseerd worden, maar de weg naar een volledige ontrafeling van de werking van probiotica is nog lang. Het onderzoek gaat echter onverminderd voort en eens een goed beeld bereikt is van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de gunstige werking van probiotica, kan de toepassing van probiotica ter preventie en behandeling van darmaandoeningen realiteit worden.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bibliografie

 

De Keersmaecker S.C.J., Braeken K., Verhoeven T.L.A., Perea Vélez M., Lebeer S., Vanderleyden J. & Hols P. (2006). Flow Cytometric Testing of Green Fluorescent Protein-Tagged Lactobacillus rhamnosus GG for Response to Defensins. Applied and Environmental Microbiology, 72, 7, 4923-4930.

Doron S., Snydman D.R. & Gorbac S.L. (2005). Lactobacillus GG: Bacteriology and Clinical Applications. Gastroenterol. Clin. N. Am., 34, 183-198.

Dunne C. & Shanahan F. (2002). Role of probiotics in the treatment of intestinal infections and inflammation. Current Opinion in Gastroenterology, 18, 40-45.

FAO/WHO (2001). Report on joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. WHO, Geneva, Switzerland.

Gupta V. & Garg R. (2009). Probiotics. Indian Journal of Medical Microbiology, 27, 3, 202-209.

Kankainen M., Paulin L., Tynkkynen S., von Ossowski I., Reunanen J., Partanen P., Satokari R., Versterlund S., Hendrickx, A.P.A., Lebeer S., De Keermaecker S.C.J., Vanderleyden J., Hämäläinen T., Laukkanen S., Salovuori N., Ritari J., Alatalo E., Korpela R., Mattila-Sandholm T., Lassig A., Hatakka K., Kinnunen K.T., Karjalainen H., Saxelin M., Laakso K., Surakka A., Palva A., Salusjärvi T., Auvinen P. & de Vos W. (2009). Comparative genomic analysis of Lactobacillus rhamnosus GG reveals pili containing a human-mucus binding protein. PNAS, 106, 40, 17193-17198.

Lebeer S., Vanderleyden J. & De Keersmaecker S.C.J. (2008). Genes and Molecules of Lactobacilli Supporting Probiotic Action. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72, 4, 728-764.

Lebeer S., Verhoeven T.L.A., Francius G., Schoofs G., Lambrichts I., Dufrêne Y., Vanderleyden J. & De Keersmaecker S.C.J. (2009). Identification of a Gene Cluster for the Biosynthesis of a Long Galactose-Rich Exopolysaccharide in Lactobacillus rhamnosus GG and Functional Analysis of the Priming Glycosyltransferase. Applied and Environmental Microbiology, 75, 11, 3554-3563.

Mackie R.I., Sghir A. & Gaskins R.H. (1999). Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. Am. J. Clin. Nutr., 69 suppl., 1035S-1045S.

Perea Vélez M., Verhoeven T.L.A., Draing C., Von Aulock S., Pfitzenmaier M., Geyer A., Lambrichts I., Grangette C., Pot B., Vanderleyden J. & De Keermaecker S.C.J. (2007a). Functional Analysis of D-Alanylation of Lipoteichoic Acid in the Probiotic Strain Lactobacillus rhamnosus GG. Applied and Environmental Microbiology, 73, 11, 3595-3604.

Preidis G.A. & Versalovic J. (2009). Targeting the Human Microbiome With Antibiotics, Probiotics, and Prebiotics: Gastroenterology Enters the Metagenomics Era. Gastroenterology, 136, 2015-2031.

Rook G.A.W. (2008). Review series on helminths, immune modulation and the hygiene hypothesis: The broader implications of the hygiene hypothesis. Immunology, 126, 3-11.

Shanahan F. (2004). Probiotics in inflammatory bowel disease – therapeutic rationale and role. Advanced Drug Delivery Reviews, 56, 809-818.

Tytgat H. (2010). Constructie en karakterisatie van rfaG mutant in Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). Eindverhandeling.

Walter J. 2005. The microecology of lactobacilli in the gastrointestinal tract. Probiotics & prebiotics: scientific aspects, 51-82.

 

 

Download scriptie (2.45 MB)
Universiteit of Hogeschool
KU Leuven
Thesis jaar
2010